304 nerūdijančio plieno ritės vamzdelių cheminis komponentas, SPACA6 ektodomeno struktūroje yra konservuota baltymų, susijusių su gametų sinteze, šeima.

Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojate naršyklės versiją su ribotu CSS palaikymu.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Be to, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stilių ir JavaScript.
Slankikliai, rodantys tris straipsnius vienoje skaidrėje.Norėdami pereiti per skaidres, naudokite mygtukus „Atgal“ ir „Kitas“ arba, norėdami pereiti per kiekvieną skaidrę, naudokite skaidrių valdiklio mygtukus pabaigoje.

SPACA6 yra spermatozoidų išreikštas paviršiaus baltymas, kuris yra labai svarbus lytinių ląstelių susiliejimui žinduolių lytinio dauginimosi metu.Nepaisant šio pagrindinio vaidmens, specifinė SPACA6 funkcija yra menkai suprantama.Išsiaiškiname SPACA6 ekstraląstelinio domeno kristalinę struktūrą, kai skiriamoji geba yra 2, 2 Å, atskleidžiant dviejų domenų baltymą, sudarytą iš keturių grandžių pluošto ir į Ig panašių β sumuštinių, sujungtų beveik lanksčiais jungikliais.Ši struktūra primena IZUMO1, kitą su gametų susiliejimu susijusį baltymą, todėl SPACA6 ir IZUMO1 yra su tręšimu susijusių baltymų superšeimos nariai, čia vadinami IST superšeima.IST superšeimą struktūriškai apibūdina susuktas keturių spiralių pluoštas ir pora su disulfidu susietų CXXC motyvų.Struktūra pagrįsta žmogaus proteomo AlphaFold paieška nustatė papildomų šios superšeimos baltymų narių;pažymėtina, kad daugelis šių baltymų dalyvauja lytinių ląstelių sintezėje.SPACA6 struktūra ir jos ryšys su kitais IST superšeimos nariais yra trūkstama mūsų žinių apie žinduolių gametų sintezė grandis.
Kiekvieno žmogaus gyvenimas prasideda nuo dviejų atskirų haploidinių lytinių ląstelių: tėvo spermos ir motinos kiaušinėlio.Šis spermatozoidas yra intensyvaus atrankos proceso nugalėtojas, kurio metu milijonai spermatozoidų praeina per moters lytinius traktus, įveikia įvairias kliūtis1 ir patiria talpą, o tai sustiprina jų judrumą ir paviršiaus komponentų procesą2,3,4.Net jei sperma ir kiaušialąstė suranda vienas kitą, procesas dar nesibaigė.Kiaušialąstę supa gumulinių ląstelių sluoksnis ir glikoproteininis barjeras, vadinamas zona pellucida, pro kurį turi praeiti spermatozoidai, kad patektų į oocitą.Spermatozoidai naudoja paviršiaus adhezijos molekulių ir su membranomis susijusių bei išskiriamų fermentų derinį, kad įveiktų šias paskutines kliūtis5.Šios molekulės ir fermentai daugiausia saugomi vidinėje membranoje ir akrosominėje matricoje ir aptinkami, kai akrosominės reakcijos metu lizuojama spermos išorinė membrana6.Paskutinis žingsnis šioje intensyvioje kelionėje yra spermatozoidų ir kiaušinėlių sintezės įvykis, kurio metu dvi ląstelės sulieja savo membranas, kad taptų vienu diploidiniu organizmu7.Nors šis procesas yra novatoriškas žmogaus dauginimosi srityje, būtinos molekulinės sąveikos yra menkai suprantamos.
Be lytinių ląstelių apvaisinimo, buvo plačiai ištirta dviejų lipidų dvisluoksnių susiliejimo chemija.Apskritai, membranų suliejimas yra energetiškai nepalankus procesas, kuriam reikalingas baltymų katalizatoriaus struktūrinis konformacijos pokytis, kuris suartina dvi membranas, nutraukia jų tęstinumą ir sukelia susiliejimą8, 9.Šie baltymų katalizatoriai yra žinomi kaip fuzogenai ir buvo rasti daugybėje sintezės sistemų.Jie reikalingi virusui patekti į šeimininko ląsteles (pvz., gp160 ŽIV-1, koronavirusų smaigalys, hemagliutininas gripo virusuose)10, 11, 12 placentos (sincitino)13, 14, 15 ir lytinių ląstelių susiliejimui žemesniuose eukariotuose ( HAP2/GCS1 augaluose, protistams ir nariuotakojams) 16,17,18,19.Žmogaus lytinių ląstelių fuzogenai dar nebuvo atrasti, nors buvo įrodyta, kad keli baltymai yra labai svarbūs lytinių ląstelių prijungimui ir susiliejimui.Pirmasis buvo atrastas oocitų ekspresuojamas CD9, transmembraninis baltymas, reikalingas pelės ir žmogaus lytinių ląstelių susiliejimui 21, 22, 23.Nors tiksli jo funkcija lieka neaiški, tikėtina, kad jo vaidmuo adhezijoje, sukibimo židinių ant kiaušinių mikrobų struktūra ir (arba) teisinga oocitų paviršiaus baltymų lokalizacija 24, 25, 26.Du tipiškiausi baltymai, kurie yra labai svarbūs gametų suliejimui, yra spermos baltymas IZUMO127 ir oocitų baltymas JUNO28, o jų tarpusavio susiejimas yra svarbus gametų atpažinimo ir adhezijos žingsnis prieš suliejimą.Izumo1 išmuštų pelių patinai ir Juno nokautuotų pelių patelės yra visiškai sterilios, šiuose modeliuose sperma patenka į perivitelinę erdvę, tačiau gametos nesusilieja.Panašiai susiliejimas sumažėjo, kai lytinės ląstelės buvo gydomos anti-IZUMO1 arba JUNO27,29 antikūnais žmogaus apvaisinimo in vitro eksperimentuose.
Neseniai buvo atrasta naujai atrasta spermatozoidų ekspresuojamų baltymų grupė, fenotipiškai panaši į IZUMO1 ir JUNO20,30,31,32,33,34,35.Didelio masto pelių mutagenezės tyrime nustatyta, kad su spermos akrosomų membrana susijęs baltymas 6 (SPACA6) yra būtinas tręšimui.Įterpus transgeną į Spaca6 geną, susidaro nesusiliejantys spermatozoidai, nors šie spermatozoidai įsiskverbia į perivitelinę erdvę36.Vėlesni išmušimo tyrimai su pelėmis patvirtino, kad gametų suliejimui reikalingas Spaca6 30,32.SPACA6 išreiškiamas beveik išimtinai sėklidėse ir jo lokalizacijos modelis yra panašus į IZUMO1, būtent spermatozoidų intimoje prieš akrosominę reakciją, o po akrosominės reakcijos migruoja į pusiaujo sritį 30, 32.Spaca6 homologai egzistuoja įvairiuose žinduoliuose ir kituose eukariotuose 30 , o jų svarba žmogaus lytinių ląstelių susiliejimui buvo įrodyta slopinant žmogaus apvaisinimą in vitro dėl atsparumo SPACA6 30 .Skirtingai nuo IZUMO1 ir JUNO, SPACA6 struktūros, sąveikos ir funkcijos detalės lieka neaiškios.
Norėdami geriau suprasti pagrindinį žmogaus spermos ir kiaušialąsčių susiliejimo procesą, kuris leis mums informuoti apie būsimus šeimos planavimo ir vaisingumo gydymo pokyčius, atlikome SPACA6 struktūrinius ir biocheminius tyrimus.SPACA6 ekstraląstelinio domeno kristalinė struktūra rodo keturių spiralių pluoštą (4HB) ir į imunoglobuliną panašų (į Ig panašų) domeną, sujungtą beveik lanksčiais regionais.Kaip prognozuota ankstesniuose tyrimuose 7, 32, 37, SPACA6 domeno struktūra yra panaši į žmogaus IZUMO1, o du baltymai turi neįprastą motyvą: 4HB su trikampiu spiraliniu paviršiumi ir pora su disulfidu susietų CXXC motyvų.Siūlome, kad IZUMO1 ir SPACA6 dabar apibrėžtų didesnę, struktūriškai susijusią baltymų, susijusių su gametų sinteze, superšeimą.Naudodami unikalias superšeimos ypatybes, atlikome išsamią AlphaFold struktūrinio žmogaus proteomo paiešką, nustatydami papildomus šios superšeimos narius, įskaitant kelis narius, dalyvaujančius lytinių ląstelių sintezėje ir (arba) tręšime.Dabar atrodo, kad yra bendra struktūrinė raukšlė ir baltymų superšeima, susijusi su gametų sinteze, o mūsų struktūra pateikia šio svarbaus žmogaus lytinių ląstelių sintezės mechanizmo aspekto molekulinį žemėlapį.
SPACA6 yra vieno praėjimo transmembraninis baltymas, turintis vieną N-susietą glikaną ir šešias galimas disulfidines jungtis (S1a ir S2 paveikslai).Mes išreiškėme ekstraląstelinį domeną žmogaus SPACA6 (likučiai 27-246) Drosophila S2 ląstelėse ir išgrynintas baltymas, naudojant nikelio afinitetą, katijonų mainus ir dydžio išskyrimo chromatografiją (S1b pav.).Išvalytas SPACA6 ektodomenas yra labai stabilus ir vienalytis.Analizė naudojant dydžio išskyrimo chromatografiją kartu su daugiakampe šviesos sklaida (SEC-MALS) atskleidė vieną smailę, kurios apskaičiuota molekulinė masė yra 26,2 ± 0,5 kDa (S1c pav.).Tai atitinka SPACA6 monomerinio ektodomeno dydį, o tai rodo, kad gryninimo metu oligomerizacija neįvyko.Be to, žiedinio dichroizmo (CD) spektroskopija atskleidė mišrią α/β struktūrą, kurios lydymosi temperatūra yra 51,3 °C (S1d, e pav.).CD spektrų dekonvoliucija atskleidė 38,6% α-spiralinių ir 15,8% β-grandinių elementų (S1d pav.).
SPACA6 ektodomenas buvo kristalizuotas naudojant atsitiktinės matricos sėjimą38, todėl buvo gautas duomenų rinkinys, kurio skiriamoji geba buvo 2, 2 Å (1 lentelė ir S3 paveikslas).Struktūrai nustatyti naudojant fragmentais pagrįstą molekulinio pakeitimo ir SAD fazavimo duomenų derinį su bromido poveikiu (1 lentelė ir S4 paveikslas), galutinį patobulintą modelį sudaro 27–246 liekanos.Tuo metu, kai buvo nustatyta struktūra, nebuvo jokių eksperimentinių ar AlphaFold struktūrų.SPACA6 ektodomenas matuoja 20 Å × 20 Å × 85 Å, susideda iš septynių spiralių ir devynių β-sruogų ir turi pailgą tretinę raukšlę, stabilizuotą šešiomis disulfidinėmis jungtimis (1a, b pav.).Silpnas elektronų tankis Asn243 šoninės grandinės gale rodo, kad ši liekana yra N-susietas glikozilinimas.Struktūrą sudaro du domenai: N-galo keturių spiralių pluoštas (4HB) ir C-galo Ig tipo domenas su tarpiniu vyrių regionu tarp jų (1c pav.).
SPACA6 ekstraląstelinio domeno struktūra.SPACA6 ekstraląstelinio domeno juostos diagrama, grandinės spalva nuo N iki C galo nuo tamsiai mėlynos iki tamsiai raudonos.Cisteinai, dalyvaujantys disulfidiniuose ryšiuose, yra paryškinti purpurine spalva.b SPACA6 ekstraląstelinio domeno topologija.Naudokite tą pačią spalvų schemą, kaip parodyta 1a paveiksle.c SPACA6 ekstraląstelinis domenas.4HB, vyrių ir Ig tipo domenų juostos diagramos yra atitinkamai oranžinės, žalios ir mėlynos spalvos.Sluoksniai nėra nubrėžti pagal mastelį.
SPACA6 4HB domeną sudaro keturios pagrindinės spiralės (1–4 spiralės), kurios yra išsidėsčiusios spiralės pavidalu (2a pav.), pakaitomis tarp lygiagrečių ir lygiagrečių sąveikų (2b pav.).Nedidelė papildoma vieno apsisukimo spiralė (spiralė 1′) klojama statmenai ryšuliui, suformuojant trikampį su 1 ir 2 sraigtais. Šis trikampis yra šiek tiek deformuotas santykinai tankios 3 ir 4 sraigtų sandaros sraigtiškai susuktoje pakuotėje ( 2a pav.).
4HB N gnybtų juostos diagrama.b Keturių spiralių pluošto vaizdas iš viršaus, kiekviena spiralė paryškinta tamsiai mėlyna spalva N gale ir tamsiai raudona C gale.c 4HB spiralinio rato diagrama iš viršaus į apačią, kiekviena liekana rodoma kaip apskritimas, pažymėtas vienos raidės aminorūgšties kodu;sunumeruotos tik keturios rato viršuje esančios aminorūgštys.Nepoliniai likučiai yra geltonos spalvos, poliniai neįkrauti likučiai yra žalia spalva, teigiamai įkrauti likučiai yra mėlyni, o neigiamai įkrauti likučiai yra raudonos spalvos.d 4HB domeno trikampiai paviršiai su 4HB oranžine spalva ir žalios spalvos vyriais.Abiejuose intarpuose yra lazdelės formos disulfidinės jungtys.
4HB yra koncentruotas vidinėje hidrofobinėje šerdyje, kurią daugiausia sudaro alifatinės ir aromatinės liekanos (2c pav.).Šerdyje yra disulfidinė jungtis tarp Cys41 ir Cys55, kuri sujungia 1 ir 2 sraigtas į viršutinį iškilų trikampį (2d pav.).Dvi papildomos disulfidinės jungtys buvo suformuotos tarp CXXC motyvo spiralės 1′ ir kito CXXC motyvo, esančio β-plaukų segtuko gale vyrių srityje (2d pav.).Konservatyvi arginino liekana, kurios funkcija nežinoma (Arg37), yra tuščiavidurio trikampio, sudaryto iš spiralių 1′, 1 ir 2, viduje. Alifatiniai anglies atomai Cβ, Cγ ir Cδ Arg37 sąveikauja su hidrofobine šerdimi, o jos guanidino grupės cikliškai juda. tarp sraigtų 1′ ir 1 per sąveiką tarp Thr32 stuburo ir šoninės grandinės (S5a, b pav.).Tyr34 tęsiasi į ertmę, palikdamas dvi mažas ertmes, per kurias Arg37 gali sąveikauti su tirpikliu.
Į Ig panašūs β sumuštiniai domenai yra didelė baltymų superšeima, kuriai būdingas bendras dviejų ar daugiau daugiagrandžių amfipatinių β lakštų, sąveikaujančių per hidrofobinę šerdį 39, bruožas. SPACA6 C-galo Ig tipo domenas turi tą patį modelį. ir susideda iš dviejų sluoksnių (S6a pav.).1 lapas yra β lapas iš keturių gijų (sruogų D, F, H ir I), kur F, H ir I gijos sudaro antilygiagretų išsidėstymą, o I ir D sruogos sąveikauja lygiagrečiai.2 lentelė yra mažas antilygiagretus dvigrandinis beta lapas (sruogos E ir G).Vidinė disulfidinė jungtis buvo pastebėta tarp E grandinės C-galo ir H grandinės centro (Cys170-Cys226) (S6b pav.).Ši disulfidinė jungtis yra analogiška disulfidinei jungtiei imunoglobulino β-sumuštiniame domene40,41.
Keturių siūlų β lakštas sukasi per visą ilgį, sudarydamas asimetrinius kraštus, kurie skiriasi forma ir elektrostatika.Plonesnis kraštas yra plokščias hidrofobinis aplinkos paviršius, kuris išsiskiria, palyginti su likusiais nelygiais ir elektrostatiškai įvairiais SPACA6 paviršiais (S6b, c pav.).Hidrofobinį paviršių supa atvirų stuburo karbonilo / amino grupių ir polinių šoninių grandinių halo (S6c pav.).Platesnė riba yra padengta ribotu spiraliniu segmentu, kuris blokuoja N-galinę hidrofobinės šerdies dalį ir sudaro tris vandenilio ryšius su F grandinės pagrindo atvira poline grupe (S6d pav.).Šio krašto C-galinė dalis sudaro didelę kišenę su iš dalies atvira hidrofobine šerdimi.Kišenę supa teigiami krūviai dėl trijų dvigubų arginino liekanų (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ir Arg212-Arg214) ir centrinio histidino (His220) rinkinių (S6e pav.).
Vyrių sritis yra trumpas segmentas tarp spiralinio domeno ir į Ig panašaus domeno, susidedantis iš vieno antilygiagrečio trijų grandžių β sluoksnio (sruogų A, B ir C), mažos 310 spiralės ir kelių ilgų atsitiktinių spiralinių segmentų.(S7 pav.).Atrodo, kad kovalentinių ir elektrostatinių kontaktų tinklas vyrių srityje stabilizuoja orientaciją tarp 4HB ir į Ig panašaus domeno.Tinklas gali būti suskirstytas į tris dalis.Pirmoje dalyje yra du CXXC motyvai (27CXXC30 ir 139CXXC142), kurie sudaro disulfidinių jungčių porą tarp β-plaukų segtuko vyryje ir 1′ spiralės 4HB.Antroji dalis apima elektrostatinę sąveiką tarp Ig tipo domeno ir vyrio.Glu132 vyryje sudaro druskos tiltelį su Arg233 į Ig panašiame domene ir Arg135 vyryje.Trečioji dalis apima kovalentinį ryšį tarp Ig panašaus domeno ir vyrių srities.Dvi disulfidinės jungtys (Cys124-Cys147 ir Cys128-Cys153) jungia vyrių kilpą su jungikliu, kurį stabilizuoja elektrostatinė sąveika tarp Gln131 ir pagrindinės funkcinės grupės, leidžiančios pasiekti pirmąjį į Ig panašų domeną.grandine.
SPACA6 ektodomeno struktūra ir atskiros 4HB ir Ig panašių domenų struktūros buvo naudojamos ieškant struktūriškai panašių įrašų baltymų duomenų bazėse 42 .Mes nustatėme atitikmenis su aukštais Dali Z balais, mažais standartiniais nuokrypiais ir dideliais LALI balais (pastarasis yra struktūriškai lygiaverčių likučių skaičius).Nors pirmųjų 10 įvykių iš visos ektodomeno paieškos (S1 lentelė) priimtinas Z balas buvo > 842, vien tik 4HB arba Ig panašaus domeno paieška parodė, kad dauguma šių įvykių atitiko tik β sumuštinius.visur esanti raukšlė, randama daugelyje baltymų.Visos trys paieškos Dali davė tik vieną rezultatą: IZUMO1.
Jau seniai buvo manoma, kad SPACA6 ir IZUMO1 turi struktūrinių panašumų 7, 32, 37.Nors šių dviejų su gametų susiliejimu susijusių baltymų ektodomenai turi tik 21% sekos tapatumo (S8a pav.), sudėtingi įrodymai, įskaitant konservuotą disulfidinio ryšio modelį ir numatomą C-galo Ig tipo domeną SPACA6, leido ankstyviems bandymams sukurti A SPACA6 pelės homologijos modelis, naudojant IZUMO1 kaip šabloną37.Mūsų struktūra patvirtina šias prognozes ir parodo tikrąjį panašumo laipsnį.Tiesą sakant, SPACA6 ir IZUMO137,43,44 struktūros turi tą pačią dviejų domenų architektūrą (S8b pav.) su panašiais 4HB ir Ig tipo β-sandwich domenais, sujungtais vyrių regione (S8c pav.).
IZUMO1 ir SPACA6 4HB turi bendrų skirtumų nuo įprastų spiralinių ryšulių.Tipiški 4HB, kaip ir tie, kurie randami SNARE baltymų kompleksuose, dalyvaujančiuose endosomų sintezėje 45, 46, turi tolygiai išdėstytas sraigtas, išlaikančias pastovų kreivumą aplink centrinę ašį 47. Priešingai, tiek IZUMO1, tiek SPACA6 spiraliniai domenai buvo iškraipyti, su kintamu kreivumu ir netolygus pakavimas (S8d pav.).Posūkis, kurį tikriausiai sukelia trikampis, sudarytas iš spiralių 1′, 1 ir 2, išlaikomas IZUMO1 ir SPACA6 ir stabilizuojamas tuo pačiu CXXC motyvu 1′ spirale.Tačiau papildoma disulfidinė jungtis, rasta SPACA6 (Cys41 ir Cys55 kovalentiškai jungiančios 1 ir 2 sraigtas aukščiau), sukuria ryškesnę viršūnę trikampio viršūnėje, todėl SPACA6 yra labiau susisukęs nei IZUMO1, o ertmės trikampiai yra ryškesni.Be to, IZUMO1 trūksta Arg37, pastebėto šios SPACA6 ertmės centre.Priešingai, IZUMO1 turi tipiškesnę hidrofobinę alifatinių ir aromatinių liekanų šerdį.
IZUMO1 turi į Ig panašų domeną, susidedantį iš dvigrandžių ir penkių grandžių β lakšto43.Papildoma IZUMO1 grandinė pakeičia SPACA6 ritę, kuri sąveikauja su F grandine, kad apribotų pagrindinius vandenilio ryšius grandinėje.Įdomus palyginimo taškas yra numatomas dviejų baltymų Ig tipo domenų paviršiaus krūvis.IZUMO1 paviršius yra labiau neigiamai įkrautas nei SPACA6 paviršius.Papildomas krūvis yra šalia C-galo, nukreipto į spermos membraną.SPACA6 tie patys regionai buvo neutralesni arba teigiamai įkrauti (S8e pav.).Pavyzdžiui, SPACA6 hidrofobinis paviršius (plonesni kraštai) ir teigiamai įkrautos duobės (platesni kraštai) yra neigiamai įkrauti IZUMO1.
Nors santykiai ir antrinės struktūros elementai tarp IZUMO1 ir SPACA6 yra gerai išsaugoti, į Ig panašių sričių struktūrinis derinimas parodė, kad šie du domenai skiriasi savo bendra orientacija vienas kito atžvilgiu (S9 pav.).IZUMO1 spiralinis pluoštas yra išlenktas apie β-sumuštinį, sukuriant anksčiau aprašytą „bumerango“ formą maždaug 50 ° kampu nuo centrinės ašies.Priešingai, SPACA6 spiralinė sija buvo pakreipta maždaug 10 ° priešinga kryptimi.Šių orientacijų skirtumai greičiausiai atsiranda dėl vyrių srities skirtumų.Pirminės sekos lygiu IZUMO1 ir SPACA6 turi mažai panašumų ties vyriais, išskyrus cisteino, glicino ir asparto rūgšties likučius.Dėl to vandeniliniai ryšiai ir elektrostatiniai tinklai yra visiškai skirtingi.β lakšto antrinės struktūros elementus dalijasi IZUMO1 ir SPACA6, nors IZUMO1 grandinės yra daug ilgesnės, o 310 spiralė (spiralė 5) yra unikali SPACA6.Dėl šių skirtumų dviejų kitaip panašių baltymų domeno orientacijos skiriasi.
Mūsų Dali serverio paieška atskleidė, kad SPACA6 ir IZUMO1 yra vienintelės dvi eksperimentiškai nustatytos struktūros, saugomos baltymų duomenų bazėje, turinčios šį konkretų 4HB raukšlę (S1 lentelė).Visai neseniai „DeepMind“ („Alphabet“ / „Google“) sukūrė „AlphaFold“ – neuroninio tinklo sistemą, kuri gali tiksliai numatyti pirminių sekų baltymų 3D struktūras48.Netrukus po to, kai išsprendėme SPACA6 struktūrą, buvo išleista AlphaFold duomenų bazė, teikianti nuspėjamuosius struktūros modelius, apimančius 98, 5% visų žmogaus proteomo baltymų48, 49.Naudojant mūsų išspręstą SPACA6 struktūrą kaip paieškos modelį, struktūrinės homologijos modelio paieška AlphaFold žmogaus proteome nustatė kandidatus, galinčius struktūrinius panašumus į SPACA6 ir IZUMO1.Atsižvelgiant į neįtikėtiną AlphaFold tikslumą numatant SPACA6 (S10a pav.), ypač 1,1 Å ektodomeną, palyginti su mūsų išspręsta struktūra (S10b pav.), galime būti tikri, kad nustatyti SPACA6 atitikmenys greičiausiai bus tikslūs.
Anksčiau PSI-BLAST ieškojo IZUMO1 klasterio su trimis kitais su sperma susijusiais baltymais: IZUMO2, IZUMO3 ir IZUMO450.AlphaFold numatė, kad šie IZUMO šeimos baltymai susilanksto į 4HB domeną su tuo pačiu disulfidinio ryšio modeliu kaip ir IZUMO1 (3a ir S11 paveikslai), nors jiems trūksta į Ig panašaus domeno.Yra hipotezė, kad IZUMO2 ir IZUMO3 yra vienpusiai membraniniai baltymai, panašūs į IZUMO1, o IZUMO4, atrodo, išskiriamas.IZUMO 2, 3 ir 4 baltymų funkcijos lytinių ląstelių sintezėje nenustatytos.Yra žinoma, kad IZUMO3 vaidina vaidmenį akrosomų biogenezėje spermos vystymosi metu51, o IZUMO baltymas sudaro kompleksą50.IZUMO baltymų išsaugojimas žinduolių, roplių ir varliagyvių organizme rodo, kad jų potenciali funkcija atitinka kitų žinomų su gametų sinteze susijusių baltymų, tokių kaip DCST1/2, SOF1 ir FIMP, funkciją.
IST superšeimos domeno architektūros diagrama su 4HB, vyriais ir į Ig panašiais domenais, atitinkamai paryškintais oranžine, žalia ir mėlyna spalva.IZUMO4 turi unikalią C terminalo sritį, kuri atrodo juoda.Patvirtinti ir numanomi disulfidiniai ryšiai rodomi atitinkamai ištisinėmis ir punktyrinėmis linijomis.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F9) (irAlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F9) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) rodomi toje pačioje spalvų diapazone kaip ir skydelis A. Disulfidiniai ryšiai rodomi purpurine spalva.TMEM95, IZUMO2 ir IZUMO3 transmembraninės spiralės nerodomos.
Skirtingai nuo IZUMO baltymo, manoma, kad kiti SPACA baltymai (ty SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 ir SPACA9) struktūriškai skiriasi nuo SPACA6 (S12 pav.).Tik SPACA9 turi 4HB, tačiau nesitikima, kad jis turės tokią pačią lygiagrečią orientaciją arba tokią pačią disulfidinę jungtį kaip SPACA6.Tik SPACA1 turi panašų į Ig panašų domeną.AlphaFold prognozuoja, kad SPACA3, SPACA4 ir SPACA5 struktūra yra visiškai kitokia nei SPACA6.Įdomu tai, kad SPACA4 taip pat vaidina svarbų vaidmenį apvaisinant, tačiau labiau nei SPACA6, o tai palengvina spermos ir oocitų zona pellucida sąveiką52.
Mūsų AlphaFold paieška rado kitą atitiktį pagal IZUMO1 ir SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, vienas spermatozoidams būdingas transmembraninis baltymas, padaro pelių patinus nevaisingus, kai jie pašalinami 32, 33.Spermatozoidai, kuriems trūksta TMEM95, turėjo normalią morfologiją, judrumą ir gebėjimą prasiskverbti į zona pellucida ir prisijungti prie kiaušinėlio membranos, tačiau negalėjo susilieti su oocitų membrana.Ankstesni tyrimai parodė, kad TMEM95 turi struktūrinių panašumų su IZUMO133.Iš tiesų, AlphaFold modelis patvirtino, kad TMEM95 yra 4HB su ta pačia CXXC motyvų pora kaip IZUMO1 ir SPACA6 ir tokia pat papildoma disulfidine jungtimi tarp 1 ir 2 spiralių, rastų SPACA6 (3a ir S11 pav.).Nors TMEM95 neturi į Ig panašaus domeno, jis turi sritį su disulfidinio ryšio modeliu, panašiu į SPACA6 ir IZUMO1 vyrių sritis (3b pav.).Šio rankraščio publikavimo metu išankstinio spausdinimo serveris pranešė apie TMEM95 struktūrą, patvirtindamas AlphaFold53 rezultatą.TMEM95 yra labai panašus į SPACA6 ir IZUMO1 ir yra evoliuciškai konservuotas jau varliagyviuose (4 ir S13 pav.).
PSI-BLAST paieška naudojo NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP ir SOF1 duomenų bazes, kad nustatytų šių sekų vietą gyvybės medyje.Atstumai tarp šakų taškų nerodomi pagal mastelį.
Įspūdingas bendras SPACA6 ir IZUMO1 struktūrinis panašumas rodo, kad jie yra konservuotos struktūrinės superšeimos, apimančios TMEM95 ir IZUMO 2, 3 ir 4 baltymus, steigėjai.žinomi nariai: IZUMO1, SPACA6 ir TMEM95.Kadangi tik keli nariai turi į Ig panašius domenus, IST superšeimos bruožas yra 4HB domenas, turintis unikalių visiems šiems baltymams būdingų bruožų: 1) Susuktas 4HB su spiralėmis, išdėstytomis antilygiagrečiai / lygiagrečiai kaitalioti (1 pav.). . 5a), 2) pluoštas turi trikampį paviršių, kurį sudaro dvi spiralės ryšulyje ir trečioji vertikali spiralė (pav. rakto sritis (5c pav.). Yra žinoma, kad CXXC motyvas, randamas į tioredoksiną panašiuose baltymuose, veikia kaip redokso jutiklis 54, 55, 56 , o IST šeimos narių motyvas gali būti siejamas su baltymų disulfidų izomerazėmis, tokiomis kaip ERp57 lytinių ląstelių sintezėje. Vaidmenys yra susiję 57, 58.
IST superšeimos narius apibrėžia trys būdingi 4HB domeno bruožai: keturios spiralės, besikeičiančios lygiagrečiai ir antiparaleliškai, ba-trikampiai spiraliniai pluošto paviršiai ir maždaug CXXC dvigubas motyvas, suformuotas tarp mažų molekulių.) N-galinės spiralės (oranžinė) ir vyrių sritis β-plaukų segtukas (žalias).
Atsižvelgiant į SPACA6 ir IZUMO1 panašumą, buvo išbandytas pirmojo gebėjimas prisijungti prie IZUMO1 arba JUNO.Biologinio sluoksnio interferometrija (BLI) yra kinetinis surišimo metodas, kuris anksčiau buvo naudojamas kiekybiškai įvertinti IZUMO1 ir JUNO sąveiką.Inkubavus biotinu pažymėtą jutiklį su IZUMO1 kaip masalu su didele JUNO analitės koncentracija, buvo aptiktas stiprus signalas (S14a pav.), rodantis surišimo sukeltą prie jutiklio antgalio pritvirtintos biomedžiagos storio pokytį.Panašūs signalai (ty JUNO prijungtas prie jutiklio kaip masalas prieš IZUMO1 analitę) (S14b pav.).Signalas nebuvo aptiktas, kai SPACA6 buvo naudojamas kaip analitė prieš jutikliu susietą IZUMO1 arba jutikliu susietą JUNO (S14a, b pav.).Šio signalo nebuvimas rodo, kad tarpląstelinis SPACA6 domenas nesąveikauja su ekstraląsteliniu IZUMO1 ar JUNO domenu.
Kadangi BLI tyrimas yra pagrįstas jauko baltyme esančių laisvų lizino liekanų biotiniliavimu, šis modifikavimas gali užkirsti kelią surišimui, jei sąveikoje dalyvauja lizino likučiai.Be to, surišimo orientacija jutiklio atžvilgiu gali sukurti sterinių kliūčių, todėl įprastiniai ištraukiami tyrimai taip pat buvo atlikti su rekombinantiniais SPACA6, IZUMO1 ir JUNO ektodomenais.Nepaisant to, SPACA6 nebuvo nuosėdų su His-pažymėtu IZUMO1 arba His-pažymėtu JUNO (S14c pav., D), o tai rodo, kad nėra sąveikos, atitinkančios tą, kuri buvo pastebėta atliekant BLI eksperimentus.Kaip teigiamą kontrolę patvirtinome JUNO sąveiką su pažymėtu His IZUMO1 (S14e ir S15 paveikslai).
Nepaisant SPACA6 ir IZUMO1 struktūrinio panašumo, SPACA6 nesugebėjimas surišti JUNO nestebina.Žmogaus IZUMO1 paviršiuje yra daugiau nei 20 likučių, sąveikaujančių su JUNO, įskaitant likučius iš kiekvieno iš trijų regionų (nors dauguma jų yra vyrių srityje) (S14f pav.).Iš šių likučių tik vienas yra išsaugotas SPACA6 (Glu70).Nors daugelis likučių pakaitalų išlaikė savo pirmines biochemines savybes, esminė Arg160 liekana IZUMO1 buvo pakeista neigiamo krūvio Asp148 SPACA6;ankstesni tyrimai parodė, kad Arg160Glu mutacija IZUMO1 beveik visiškai panaikina prisijungimą prie JUNO43.Be to, domeno orientacijos skirtumas tarp IZUMO1 ir SPACA6 žymiai padidino SPACA6 lygiaverčio regiono JUNO surišimo vietos paviršiaus plotą (S14g pav.).
Nepaisant žinomo SPACA6 poreikio gametų suliejimui ir jo panašumo į IZUMO1, SPACA6 neturi lygiavertės JUNO surišimo funkcijos.Todėl mes siekėme sujungti savo struktūrinius duomenis su evoliucinės biologijos teikiamais svarbos įrodymais.SPACA6 homologų sekos suderinimas rodo bendros struktūros išsaugojimą už žinduolių ribų.Pavyzdžiui, cisteino liekanų yra net toli gimininguose varliagyviuose (6a pav.).Naudojant „ConSurf“ serverį, SPACA6 paviršiuje buvo susieti 66 sekų kelių sekų suderinimo išsaugojimo duomenys.Šio tipo analizė gali parodyti, kurios liekanos buvo išsaugotos baltymų evoliucijos metu ir gali parodyti, kurios paviršiaus sritys vaidina svarbų vaidmenį.
SPACA6 ektodomenų iš 12 skirtingų rūšių sekos suderinimas, paruoštas naudojant CLUSTAL OMEGA.„ConSurf“ analizės duomenimis, konservatyviausios pozicijos pažymėtos mėlyna spalva.Cisteino likučiai paryškinti raudonai.Domeno ribos ir antrinės struktūros elementai rodomi išlygiavimo viršuje, kur rodyklės rodo β-sruogas, o bangos rodo sraigtas.NCBI prieigos identifikatoriai, kuriuose yra sekos, yra: žmogus (Homo sapiens, NP_001303901), mandrilis (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapucinas beždžionė (Cebus mimic, XP_017359366), arklys (Equus caballus), (Equus caballus) (Equus caballus, 06 w0101) XP_032_034) .), avys (Ovis aries, XP_014955560), dramblys (Loxodonta africana, XP_010585293), šuo (Canis lupus familyis, XP_025277208), pelė (Mus musculus, NP_001156381), XPi_01 XParphi_1, velnias XP3_0 ), plekšnė, 8) , 61_89 ir Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Numeravimas pagrįstas žmonių tvarka.b SPACA6 struktūros paviršiaus vaizdas su 4HB viršuje ir Ig tipo domenu apačioje, spalvos pagrįstos išsaugojimo įvertinimais iš ConSurf serverio.Geriausiai išsilaikiusios dalys yra mėlynos, vidutiniškai išsilaikiusios – baltos, o mažiausiai išsilaikiusios – geltonos.violetinis cisteinas.Trys paviršiaus lopai, demonstruojantys aukštą apsaugos lygį, pavaizduoti 1, 2 ir 3 pažymėtuose lopuose. 4HB animacinis filmas parodytas įdėkle viršuje dešinėje (ta pati spalvų schema).
SPACA6 struktūra turi tris labai konservuotas paviršiaus sritis (6b pav.).1 pleistras apima 4HB ir vyrių sritį, jame yra du konservuoti CXXC disulfidiniai tilteliai, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 vyrių tinklas (S7 pav.) ir trys konservuoti išoriniai aromatiniai likučiai (Phe31, Tyr73, Phe137)).platesnis Ig tipo domeno kraštas (S6e pav.), Kuris yra keletas teigiamai įkrautų likučių spermos paviršiuje.Įdomu tai, kad šiame pleistre yra antikūnų epitopas, kuris anksčiau buvo įrodytas trukdantis SPACA6 30 funkcijai.3 sritis apima vyrį ir vieną Ig tipo domeno pusę;šiame regione yra konservuotų prolinų (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ir į išorę nukreiptų polinių / įkrautų liekanų.Keista, kad dauguma likučių 4HB paviršiuje yra labai kintami (6b pav.), nors raukšlė yra konservuota visame SPACA6 homologe (kaip rodo hidrofobinio pluošto šerdies konservatyvumas) ir už IST superšeimos ribų.
Nors tai yra mažiausias SPACA6 regionas su mažiausiai aptinkamų antrinės struktūros elementų, daugelis vyrių regiono liekanų (įskaitant 3 regioną) yra labai konservuoti tarp SPACA6 homologų, o tai gali reikšti, kad spiralinio pluošto ir β-sumuštinio orientacija vaidina svarbų vaidmenį.kaip konservatorius.Tačiau, nepaisant plačių vandenilio jungčių ir elektrostatinių tinklų SPACA6 ir IZUMO1 vyrių srityje, vidinio lankstumo įrodymus galima pastebėti suderinant daugybę leidžiamų IZUMO137, 43, 44 struktūrų.Atskirų sričių derinimas gerai sutapo, tačiau domenų orientacija vienas kito atžvilgiu svyravo nuo 50° iki 70° nuo centrinės ašies (S16 pav.).Norint suprasti SPACA6 konformacinę dinamiką tirpale, buvo atlikti SAXS eksperimentai (S17a, b pav.).Ab initio rekonstrukcija SPACA6 ektodomenas atitiko strypo kristalų struktūrą (S18 pav.), nors Kratky sklypas parodė tam tikrą lankstumą (S17b pav.).Ši konformacija prieštarauja IZUMO1, kurioje nesurištas baltymas įgauna bumerango formą tiek grotelėje, tiek tirpale43.
Norint konkrečiai identifikuoti lanksčią sritį, SPACA6 buvo atlikta vandenilio-deuterio mainų masių spektroskopija (H-DXMS) ir palyginta su duomenimis, anksčiau gautais naudojant IZUMO143 (7a, b pav.).SPACA6 yra akivaizdžiai lankstesnis nei IZUMO1, kaip rodo didesnis deuterio mainas visoje struktūroje po 100 000 s mainų.Abiejose struktūrose vyrių srities C-galinė dalis rodo aukštą mainų lygį, kuris tikriausiai leidžia ribotą 4HB ir Ig tipo domenų sukimąsi vienas kito atžvilgiu.Įdomu tai, kad SPACA6 vyrio C-galinė dalis, susidedanti iš 147CDLPLDCP154 liekanos, yra labai konservuota 3 sritis (6b pav.), galbūt tai rodo, kad tarpdomeninis lankstumas yra evoliuciškai konservuota SPACA6 savybė.Pagal lankstumo analizę, CD terminio lydalo duomenys parodė, kad SPACA6 (Tm = 51,2°C) yra mažiau stabilus nei IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (S1e ir S19 pav.).
SPACA6 ir b IZUMO1 H-DXMS vaizdai.Deuterio mainų procentas buvo nustatytas nurodytais laiko momentais.Vandenilio ir deuterio mainų lygiai rodomi spalva gradiento skalėje nuo mėlynos (10%) iki raudonos (90%).Juodosios dėžės žymi didelio mainų sritis.Kristalinėje struktūroje pastebėtos 4HB, šarnyro ir Ig tipo domeno ribos parodytos virš pirminės sekos.Deuterio mainų lygiai esant 10 s, 1000 s ir 100 000 s buvo pavaizduoti juostinėje diagramoje, uždėtoje ant skaidrių SPACA6 ir IZUMO1 molekulinių paviršių.Konstrukcijų, kurių deuterio mainų lygis mažesnis nei 50%, dalys yra baltos spalvos.Sritys, viršijančios 50 % H-DXMS mainų, yra nuspalvintos gradiento skalėje.
Naudojant CRISPR / Cas9 ir pelių genų išmušimo genetines strategijas, buvo nustatyti keli veiksniai, svarbūs spermatozoidų ir kiaušinių surišimui ir susiliejimui.Be gerai apibūdintos IZUMO1-JUNO ir CD9 struktūros sąveikos, dauguma baltymų, susijusių su gametų sinteze, išlieka struktūriškai ir funkciškai mįslingi.SPACA6 biofizinė ir struktūrinė charakteristika yra dar viena sukibimo / sintezės molekulinės dėlionės dalis tręšimo metu.
Atrodo, kad SPACA6 ir kiti IST superšeimos nariai yra labai konservuoti žinduolių, taip pat atskirų paukščių, roplių ir varliagyvių tarpe;Tiesą sakant, manoma, kad SPACA6 netgi reikalingas zebrafish 59 apvaisinimui. Šis pasiskirstymas panašus į kitus žinomus su gametų susiliejimu susijusius baltymus, tokius kaip DCST134, DCST234, FIMP31 ir SOF132, o tai rodo, kad šiems veiksniams trūksta HAP2 (taip pat žinomas kaip GCS1) baltymai, atsakingi už daugelio protistų katalizinį aktyvumą., augalai ir nariuotakojai.Apvaisinti sulieti baltymai 60, 61. Nepaisant didelio SPACA6 ir IZUMO1 struktūrinio panašumo, genų, koduojančių bet kurį iš šių baltymų, išmušimas sukėlė pelių patinų nevaisingumą, o tai rodo, kad jų funkcijos lytinių ląstelių sintezėje nesidubliuoja..Kalbant plačiau, nė vienas iš žinomų spermos baltymų, reikalingų sintezės adhezijos fazei, nėra nereikalingas.
Lieka atviras klausimas, ar SPACA6 (ir kiti IST superšeimos nariai) dalyvauja tarpgametinėse jungtyse, formuoja intragametinius tinklus, kad į sintezės taškus įdarbintų svarbius baltymus, ar galbūt net veikia kaip sunkiai suvokiami fuzogenai.Bendro imunoprecipitacijos tyrimai HEK293T ląstelėse atskleidė sąveiką tarp viso ilgio IZUMO1 ir SPACA632.Tačiau mūsų rekombinantiniai ektodomenai in vitro nesąveikavo, o tai rodo, kad sąveika, pastebėta Noda ir kt.abu buvo ištrinti konstrukcijoje (atkreipkite dėmesį į IZUMO1 citoplazminę uodegą, kuri, kaip įrodyta, yra nereikalinga tręšimui62).Arba IZUMO1 ir (arba) SPACA6 gali reikalauti specifinės surišimo aplinkos, kurios mes neatkuriame in vitro, pvz., fiziologiškai specifinės konformacijos arba molekuliniai kompleksai, kuriuose yra kitų baltymų (žinomų arba dar neatrastų).Nors manoma, kad IZUMO1 ektodomenas tarpininkauja spermatozoidams prijungti prie kiaušinėlio perivitelinėje erdvėje, SPACA6 ektodomeno paskirtis neaiški.
SPACA6 struktūra atskleidžia keletą konservuotų paviršių, kurie gali būti susiję su baltymų ir baltymų sąveika.Konservuota vyrio srities dalis, esanti tiesiai greta CXXC motyvo (pažymėta 1 pataisymu aukščiau), turi keletą į išorę nukreiptų aromatinių liekanų, kurios dažnai yra susijusios su hidrofobine ir π-statybos sąveika tarp biomolekulių.Plačios į Ig panašaus domeno pusės (2 sritis) sudaro teigiamai įkrautą griovelį su labai konservuotomis Arg ir His liekanomis, o antikūnai prieš šį regioną anksčiau buvo naudojami lytinių ląstelių susiliejimui blokuoti30.Antikūnas atpažįsta linijinį epitopą 212RIRPAQLTHRGTFS225, kuris turi tris iš šešių arginino liekanų ir labai konservuotą His220.Neaišku, ar disfunkcija atsirado dėl šių specifinių likučių blokavimo, ar viso regiono.Šio tarpo vieta netoli β-sumuštinio C-galo rodo cis-sąveiką su kaimyniniais spermos baltymais, bet ne su oocitų baltymais.Be to, labai lankstaus prolino turtingo raizginio (3 vieta) išlaikymas vyryje gali būti baltymų ir baltymų sąveikos vieta arba, labiau tikėtina, reikšti, kad tarp dviejų domenų išlaikomas lankstumas.Lytis yra svarbi nežinomam SPACA6 vaidmeniui.lytinių ląstelių susiliejimas.
SPACA6 turi tarpląstelinių adhezijos baltymų savybių, įskaitant į Ig panašius β sumuštinius.Daugelis lipnių baltymų (pvz., kadherinai, integrinai, adhezinai ir IZUMO1) turi vieną ar daugiau β-sumuštinių domenų, kurie išplečia baltymus nuo ląstelės membranos iki jų aplinkos tikslų63, 64, 65.Į Ig panašus SPACA6 domenas taip pat turi motyvą, dažniausiai randamą sukibimo ir sanglaudos β-sumuštiniuose: lygiagrečių gijų dubletai β-sumuštinių galuose, žinomi kaip mechaniniai spaustukai66.Manoma, kad šis motyvas padidina atsparumą šlyties jėgoms, o tai vertinga baltymams, dalyvaujantiems tarpląstelinėje sąveikoje.Tačiau, nepaisant šio panašumo į adhezinus, šiuo metu nėra įrodymų, kad SPACA6 sąveikauja su kiaušinių baltymais.SPACA6 ektodomenas negali prisijungti prie JUNO, o SPACA6 ekspresuojančios HEK293T ląstelės, kaip parodyta čia, beveik nesąveikauja su oocitais, kuriems trūksta zonos 32 .Jei SPACA6 užmezga tarpgametinius ryšius, dėl šios sąveikos gali prireikti modifikacijų po transliacijos arba gali būti stabilizuotos kitų spermos baltymų.Remiantis pastarąja hipoteze, IZUMO1 trūkumas spermatozoidai jungiasi su oocitais, parodydami, kad kitos molekulės nei IZUMO1 dalyvauja gametų adhezijos etape27.
Daugelis virusinių, ląstelių ir vystymosi sulietų baltymų turi savybių, kurios numato jų, kaip fuzogenų, funkciją.Pavyzdžiui, virusiniai sulieti glikoproteinai (I, II ir III klasės) turi hidrofobinį sulietą peptidą arba kilpą baltymo gale, kuris įterpiamas į šeimininko membraną.IZUMO143 hidrofiliškumo žemėlapis ir IST superšeimos struktūra (nustatyta ir prognozuojama) neparodė jokio akivaizdaus hidrofobinio sulieto peptido.Taigi, jei kokie nors IST superšeimos baltymai veikia kaip fuzogenai, jie tai daro kitaip nei kiti žinomi pavyzdžiai.
Apibendrinant galima pasakyti, kad IST baltymų superšeimos narių funkcijos, susijusios su gametų sinteze, išlieka viliojanti paslaptis.Mūsų apibūdinta SPACA6 rekombinantinė molekulė ir jos išspręsta struktūra suteiks įžvalgos apie šių bendrų struktūrų ryšius ir jų vaidmenį lytinių ląstelių prijungime ir sintezėje.
DNR seka, atitinkanti numatomą žmogaus SPACA6 ektodomeną (NCBI registracijos numeris NP_001303901.1; liekanos 27–246), buvo optimizuota kodonu ekspresijai Drosophila melanogaster S2 ląstelėse ir susintetinta kaip geno fragmentas su seka, koduojančia Kozak (Eurofins Genomics)., BiP sekrecijos signalas ir atitinkami 5′ ir 3′ galai, skirti nuo ligavimo nepriklausomam šio geno klonavimui į pMT ekspresijos vektorių, pagrįstą metalotioneino promotoriumi, modifikuotu atrankai su puromicinu (pMT-puro).pMT-puro vektorius koduoja trombino skilimo vietą, po kurios yra 10x-His C-galo žyma (S2 pav.).
Stabili SPACA6 pMT-puro vektoriaus transfekcija į D. melanogaster S2 (Gibco) ląsteles buvo atlikta panašiai kaip ir IZUMO1 ir JUNO43 protokole.S2 ląstelės buvo atšildytos ir auginamos Schneiderio terpėje (Gibco), kuri buvo papildyta galutine 10% (t/v) termiškai inaktyvuotu veršelio vaisiaus serumu (Gibco) ir 1X antimikotiniu antibiotiku (Gibco).Ankstyvo pasėjimo ląstelės (3,0 x 106 ląstelės) buvo dedamos į atskirus 6 šulinėlių plokštelių šulinėlius (Corning).Po 24 valandų inkubacijos 27 ° C temperatūroje ląstelės buvo transfekuotos 2 mg SPACA6 pMT-puro vektoriaus ir Effectene transfekcijos reagento (Qiagen) mišiniu pagal gamintojo protokolą.Transfekuotos ląstelės buvo inkubuojamos 72 valandas, o po to surenkamos 6 mg / ml puromicino.Tada ląstelės buvo išskirtos iš pilnos Schneiderio terpės ir dedamos į serumo neturinčią Insect-XPRESS terpę (Lonza), kad būtų galima gaminti didelius baltymus.1 l S2 ląstelių kultūros partija buvo auginama iki 8–10 × 106 ml-1 ląstelių 2 l vėdinamoje plokščiadugnėje polipropileno Erlenmejerio kolboje, po to sterilizuota galutine 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) koncentracija ir steriliai filtruojama.sukeltas.Sukeltos kultūros keturias dienas buvo inkubuojamos 27 °C temperatūroje 120 aps./min.
Kondicionuota terpė, kurioje yra SPACA6, buvo išskirta centrifuguojant 5660 × g 4 ° C temperatūroje, po to naudojant Centramate tangentinio srauto filtravimo sistemą (Pall Corp) su 10 kDa MWCO membrana.Koncentruotą terpę, kurioje yra SPACA6, užtepkite ant 2 ml Ni-NTA agarozės dervos (Qiagen) kolonėlės.Ni-NTA derva buvo plaunama 10 kolonėlės tūrių (CV) buferio A, tada buvo pridėta 1 CV buferio A, kad galutinė imidazolo koncentracija būtų 50 mM.SPACA6 buvo išplautas 10 ml buferio A, papildyto imidazolu iki galutinės 500 mM koncentracijos.Restrikcijos klasės trombinas (Millipore Sigma) buvo pridėtas tiesiai į dializės vamzdelį (MWCO 12-14 kDa) po 1 vienetą mg SPACA6, palyginti su 1 l 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 ir 150 mM NaCl (buferis B) dializei.) 4 °C temperatūroje 48 valandas.Tada trombinu suskaidytas SPACA6 buvo atskiestas tris kartus, kad sumažintų druskos koncentraciją, ir įkeltas į 1 ml MonoS 5/50 GL katijonų mainų kolonėlę (Cytiva/GE), subalansuotą 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Katijonų keitiklis buvo plaunamas 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, tada SPACA6 buvo eliuuojamas linijiniu gradientu nuo 0 iki 500 mM NaCl 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 25 CV.Po jonų mainų chromatografijos SPACA6 buvo sukoncentruotas iki 1 ml ir izokratiškai eliuuojamas iš ENrich SEC650 10 x 300 kolonėlės (BioRad), subalansuotos buferiu B. Pagal chromatogramą surinkite ir koncentruokite frakcijas, kuriose yra SPACA6.Grynumas buvo kontroliuojamas Coomassie dažytu elektroforeze ant 16% SDS-poliakrilamido gelio.Baltymų koncentracija buvo kiekybiškai įvertinta absorbcija esant 280 nm, naudojant Beer-Lambert dėsnį ir teorinį molinį išnykimo koeficientą.
Išgrynintas SPACA6 buvo dializuojamas per naktį prieš 10 mM natrio fosfatą, pH 7,4 ir 150 mM NaF, ir prieš analizuojant CD spektroskopija praskiedžiamas iki 0,16 mg/ml.Kompaktinių diskų, kurių bangos ilgis nuo 185 iki 260 nm, spektrinis nuskaitymas buvo renkamas Jasco J-1500 spektropoliarimetru, naudojant kvarcines kiuvetes su 1 mm optinio kelio ilgiu (Helma) 25 °C temperatūroje 50 nm/min greičiu.CD spektrai buvo pakoreguoti pradine linija, apskaičiuoti per 10 gavimo vidurkį ir konvertuoti į vidutinį liekamąjį elipsiškumą (θMRE) laipsniais cm2/dmol:
čia MW yra kiekvieno mėginio molekulinė masė Da;N yra aminorūgščių skaičius;θ – elipsiškumas mililaipsniais;d atitinka optinio kelio ilgį cm;baltymų koncentracija vienetais.