304 Nerūdijančio plieno suvirintas suvyniotas vamzdis / vamzdelio cheminis zomponentas, pasaulinės jūrų mikrobiomos biosintetinis potencialas

Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojate naršyklės versiją su ribotu CSS palaikymu.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Be to, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stilių ir JavaScript.
Slankikliai, rodantys tris straipsnius vienoje skaidrėje.Norėdami pereiti per skaidres, naudokite mygtukus „Atgal“ ir „Kitas“ arba, norėdami pereiti per kiekvieną skaidrę, naudokite skaidrių valdiklio mygtukus pabaigoje.

Išsamus prekės aprašymas

304 Nerūdijančio plieno suvirintas suvyniotas vamzdis / vamzdelis
1. Specifikacija: Nerūdijančio plieno ritės vamzdis / vamzdeliai
2. Tipas: suvirintas arba besiūlis
3. Standartas: ASTM A269, ASTM A249
4. Nerūdijančio plieno ritės vamzdžio OD: nuo 6 mm iki 25,4 mm
5. Ilgis: 600-3500MM arba pagal kliento reikalavimą.
6. Sienelės storis: nuo 0,2 mm iki 2,0 mm.

7. Tolerancija: OD: +/-0,01mm;Storis: +/-0,01%.

8. Ritės vidinės angos dydis: 500-1500 mm (gali būti reguliuojamas pagal kliento reikalavimus)

9. Ritės aukštis: 200-400 mm (gali būti reguliuojamas pagal kliento reikalavimus)

10. Paviršius: šviesus arba atkaitintas
11. Medžiaga: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, lydinys 625, 825, 2205, 2507 ir kt.
12. Pakavimas: austi maišeliai mediniame dėkle, medinis padėklas, medinis velenas arba pagal kliento reikalavimus
13. Bandymas: cheminis komponentas, takumo riba, atsparumas tempimui, kietumo matavimas
14. Garantija: trečiosios šalies (pvz. :SGS TV ) patikrinimas ir kt.
15. Taikymas: apdaila, baldai, naftos transportavimas, šilumokaičiai, turėklų gamyba, popieriaus gamyba, automobiliai, maisto perdirbimas, medicina ir kt.

Natūralios mikrobų bendruomenės yra įvairios filogenetiškai ir metaboliškai.Be nepakankamai ištirtų organizmų grupių1, ši įvairovė taip pat turi didelį potencialą atrasti ekologiškai ir biotechnologiškai reikšmingus fermentus ir biocheminius junginius2,3.Tačiau šios įvairovės tyrimas, siekiant nustatyti genominius kelius, kurie sintezuoja tokius junginius ir susieja juos su atitinkamais šeimininkais, išlieka iššūkiu.Mikroorganizmų biosintetinis potencialas atvirame vandenyne iš esmės nežinomas dėl viso genomo skiriamosios gebos duomenų analizės pasauliniu mastu apribojimų.Čia mes tyrinėjame vandenyno biosintetinių genų grupių įvairovę ir įvairovę, integruodami apie 10 000 mikrobų genomų iš kultivuotų ląstelių ir pavienių ląstelių su daugiau nei 25 000 naujai rekonstruotų genomų iš daugiau nei 1 000 jūros vandens mėginių.Šios pastangos nustatė apie 40 000 numanomų daugiausia naujų biosintetinių genų grupių, kai kurios iš jų buvo aptiktos anksčiau neįtartose filogenetinėse grupėse.Šiose populiacijose mes nustatėme liniją, praturtintą biosintetinių genų klasteriais („Candidatus Eudormicrobiaceae“), priklausančiais nekultivuojamų bakterijų prieglobsčiui ir apimančius keletą biosintetiškai įvairiausių mikroorganizmų šioje aplinkoje.Iš jų apibūdinome fosfatazės-peptido ir pitonamido kelius, atitinkamai nustatydami neįprastos bioaktyvaus junginio struktūros ir fermentologijos atvejus.Apibendrinant, šis tyrimas parodo, kaip mikrobiomu pagrįstos strategijos gali leisti tyrinėti anksčiau neaprašytus fermentus ir natūralų maistą prastai suprantamoje mikrobiotoje ir aplinkoje.
Mikrobai skatina pasaulinius biogeocheminius ciklus, palaiko maisto tinklus ir saugo augalus bei gyvūnus5.Didžiulė jų filogenetinė, metabolinė ir funkcinė įvairovė suteikia daug galimybių atrasti naujų taksonų1, fermentų ir biocheminių junginių, įskaitant natūralius produktus6.Ekologinėse bendruomenėse šios molekulės suteikia mikroorganizmams įvairias fiziologines ir ekologines funkcijas – nuo ​​bendravimo iki konkurencijos 2, 7 .Be savo pradinių funkcijų, šie natūralūs produktai ir jų genetiškai užkoduoti gamybos būdai yra biotechnologinių ir terapinių pritaikymų pavyzdžiai2,3.Tokių kelių ir jungčių identifikavimą labai palengvino kultivuotų mikrobų tyrimas.Tačiau natūralios aplinkos taksonominiai tyrimai parodė, kad didžioji dauguma mikroorganizmų nebuvo auginami8.Šis kultūrinis šališkumas riboja mūsų galimybes išnaudoti daugelio mikrobų užkoduotą funkcinę įvairovę 4, 9.
Siekiant įveikti šiuos apribojimus, pastarojo dešimtmečio technologinė pažanga leido tyrėjams tiesiogiai (ty be išankstinės kultūros) sekti mikrobų DNR fragmentus iš ištisų bendruomenių (metagenomika) arba pavienių ląstelių.Galimybė surinkti šiuos fragmentus į didesnius genomo fragmentus ir atitinkamai rekonstruoti kelis metagenomiškai surinktus genomus (MAG) arba pavienius amplifikuotus genomus (SAG), atveria svarbią galimybę taksocentriniams mikrobiomo (ty mikrobų bendruomenių ir mikrobiomo) tyrimams.nutiesti naujus kelius.savo genetinę medžiagą tam tikroje aplinkoje) 10,11,12.Iš tiesų, naujausi tyrimai labai išplėtė filogenetinį mikrobų įvairovės vaizdą Žemėje1, 13 ir atskleidė didelę atskirų mikrobų bendruomenių funkcinės įvairovės dalį, kuri anksčiau nebuvo įtraukta į kultivuojamų mikroorganizmų etaloninių genomo sekų (REF)14.Gebėjimas įtraukti neatrastą funkcinę įvairovę į šeimininko genomo kontekstą (ty genomo skiriamąją gebą) yra labai svarbus norint numatyti dar neapibūdintas mikrobų linijas, kurios, tikėtina, koduoja naujus natūralius produktus 15, 16 arba atsekti tokius junginius iki jų pradinio gamintojo17.Pavyzdžiui, taikant kombinuotą metagenominės ir vienos ląstelės genominės analizės metodą, Candidatus Entotheonella, metaboliškai turtingų su kempine susijusių bakterijų grupė, buvo identifikuota kaip įvairių vaistų potencialo gamintoja18.Tačiau, nepaisant pastarojo meto bandymų tirti įvairias mikrobų bendruomenes16,19, vis dar trūksta daugiau nei dviejų trečdalių pasaulinių metagenominių duomenų apie didžiausią Žemės ekosistemų vandenyną16,20.Taigi apskritai jūros mikrobiomo biosintetinis potencialas ir jo, kaip naujų fermentinių ir natūralių produktų saugyklos, potencialas iš esmės lieka nepakankamai ištirtas.
Norėdami ištirti jūrų mikrobiomų biosintetinį potencialą pasauliniu mastu, pirmiausia sujungėme jūrų mikrobų genomus, gautus naudojant nuo kultūros priklausomus ir ne kultūros metodus, kad sukurtume plačią filogenetikos ir genų funkcijos duomenų bazę.Šios duomenų bazės tyrimas atskleidė daugybę biosintetinių genų grupių (BGC), kurių dauguma priklauso dar neapibūdintoms genų klasterių (GCF) šeimoms.Be to, mes nustatėme nežinomą bakterijų šeimą, kuri iki šiol pasižymi didžiausia žinoma BGC įvairove atvirame vandenyne.Eksperimentiniam patvirtinimui pasirinkome du ribosomų sintezės ir po transliacijos modifikuotų peptidų (RiPP) kelius, remiantis jų genetiniais skirtumais nuo šiuo metu žinomų kelių.Funkcinis šių kelių apibūdinimas atskleidė netikėtus fermentologijos pavyzdžius, taip pat struktūriškai neįprastus junginius, turinčius proteazę slopinantį aktyvumą.
Iš pradžių siekėme sukurti pasaulinį duomenų šaltinį genomo analizei, sutelkdami dėmesį į jo bakterinius ir archeologinius komponentus.Šiuo tikslu mes sujungėme metagenominius duomenis ir 1038 jūros vandens mėginius iš 215 visame pasaulyje paskirstytų mėginių ėmimo vietų (platumos diapazonas = 141,6 °) ir kelių gilių sluoksnių (nuo 1 iki 5600 m gylio, apimančių pelagines, mezolagines ir bedugnes zonas).Fonas 21, 22, 23 (1a pav., išplėstiniai duomenys, 1a pav. ir 1 papildoma lentelė).Be plačios geografinės aprėpties, šie selektyviai filtruoti mėginiai leido palyginti įvairius jūrų mikrobiomo komponentus, įskaitant daug virusų (<0,2 µm), daug prokariotų (0,2–3 µm), daug dalelių (0,8 µm). ).–20 µm) ir virusų išsekusios (>0,2 µm) kolonijos.
a, Iš viso 1038 viešai prieinami jūrų mikrobų bendruomenių genomai (metagenomika), surinkti iš 215 visame pasaulyje paskirstytų vietų (62° S iki 79° šiaurės platumos ir 179° vakarų ilgumos iki 179° rytų ilgumos).Žemėlapio plytelės © Esri.Šaltiniai: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ ir Esri.b, šios metagenomos buvo naudojamos rekonstruoti MAG (metodai ir papildoma informacija), kurių kiekis ir kokybė (metodai) skiriasi duomenų rinkiniuose (pažymėtuose spalva).Rekonstruoti MAG buvo papildyti viešai prieinamais (išoriniais) genomais, įskaitant rankų darbo MAG26, SAG27 ir REF.27 Sudaryti OMD.c, palyginti su ankstesnėmis ataskaitomis, pagrįstomis tik SAG (GORG)20 arba MAG (GEM)16, OMD pagerina jūrų mikrobų bendruomenių genominį apibūdinimą (metagenominio skaitymo kartografavimo greitis; metodas) du ar tris kartus, nuosekliau vaizduodamas gylį ir platumos..<0,2, n = 151, 0,2-0,8, n = 67, 0,2-3, n = 180, 0,8-20, n = 30, > 0,2, n = 610, <30°, n = 132, 30-60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, GPGB, n = 28. d, OMD grupavimas į rūšių klasterius (95 % vidutinis nukleotidų tapatumas) identifikuoja bendrą apie 8300 rūšių, iš kurių daugiau nei pusė anksčiau nebuvo apibūdintos pagal taksonomines anotacijas naudojant GTDB (89 versija) e, rūšių klasifikavimas pagal genomo tipą parodė, kad MAG, SAG ir REF gerai papildo vienas kitą, atspindėdami filogenetinę įvairovę. jūrų mikrobiomas.Visų pirma, 55%, 26% ir 11% rūšių buvo būdingos atitinkamai MAG, SAG ir REF.BATS, Bermudų Atlanto laiko serija;GEM, Žemės mikrobiomo genomai;GORG, pasaulinis vandenyno etaloninis genomas;HOT, Havajų vandenyno laiko eilutė.
Naudodami šį duomenų rinkinį, iš viso atkūrėme 26 293 MAG, daugiausia bakterinių ir archeologinių (1b pav. ir išplėsti duomenys, 1b pav.).Šiuos MAG sukūrėme iš rinkinių iš atskirų, o ne sujungtų metagenominių mėginių, kad išvengtume natūralių sekos variacijų tarp mėginių iš skirtingų vietų ar laiko taškų (metodų) žlugimo.Be to, mes sugrupavome genominius fragmentus pagal jų paplitimo koreliacijas daugelyje mėginių (nuo 58 iki 610 mėginių, priklausomai nuo tyrimo; metodas).Pastebėjome, kad tai daug laiko reikalaujantis, bet svarbus žingsnis24, kuris buvo praleistas atliekant kelis didelio masto MAG16, 19, 25 rekonstrukcijos darbus ir žymiai pagerina kiekybę (vidutiniškai 2,7 karto) ir kokybę (vidutiniškai +20 %). genomo.rekonstruota iš čia tirto jūrinio metagenomo (išplėstiniai duomenys, 2a pav. ir papildoma informacija).Apskritai dėl šių pastangų jūros mikrobų MAG padidėjo 4,5 karto (6 kartus, jei atsižvelgiama tik į aukštos kokybės MAG), palyginti su šiuo metu turimais išsamiausiais MAG ištekliais16 (metodai).Šis naujai sukurtas MAG rinkinys buvo sujungtas su 830 rankomis atrinktų MAG26, 5969 SAG27 ir 1707 REF.Dvidešimt septynios jūrinių bakterijų ir archėjų rūšys sudarė kombinatorinę 34 799 genomų kolekciją (1b pav.).
Tada įvertinome naujai sukurtą išteklį, kad pagerintume jo gebėjimą atstovauti jūrų mikrobų bendruomenėms ir įvertinti skirtingų genomo tipų integravimo poveikį.Vidutiniškai nustatėme, kad ji apima maždaug 40–60 % jūrų metagenominių duomenų (1c pav.), o tai du ar tris kartus daugiau nei ankstesnių MAG ataskaitų aprėptis tiek gylyje, tiek platumoje. Daugiau serijos 16 arba SAG20.Be to, norėdami sistemingai išmatuoti taksonominę įvairovę nustatytose kolekcijose, anotavome visus genomus naudodami genomo taksonomijos duomenų bazės (GTDB) įrankių rinkinį (metodus) ir naudojome vidutinį 95% genomo nukleotidų tapatumą.28 nustatyti 8304 rūšių grupes (rūšis).Du trečdaliai šių rūšių (įskaitant naujus kladus) anksčiau nebuvo pasirodžiusios GTDB, iš kurių 2790 buvo aptiktos naudojant šiame tyrime rekonstruotą MAG (1d pav.).Be to, mes nustatėme, kad skirtingų tipų genomai labai papildo vienas kitą: 55%, 26% ir 11% rūšių sudaro atitinkamai MAG, SAG ir REF (1e pav.).Be to, MAG apėmė visus 49 tipus, esančius vandens storymėje, o SAG ir REF – tik 18 ir 11 iš jų.Tačiau SAG geriau atspindi labiausiai paplitusių kladų įvairovę (išplėsti duomenys, 3a pav.), tokių kaip Pelagic Bacteriales (SAR11), SAG apima beveik 1300 rūšių, o MAG - tik 390 rūšių.Pažymėtina, kad REF retai sutapdavo su MAG arba SAG rūšių lygmeniu ir sudarė > 95% iš maždaug 1000 genomų, kurių nebuvo čia tirtuose atviro vandenyno metagenominiuose rinkiniuose, daugiausia dėl sąveikos su kitų tipų izoliuotais tipiniais jūrų egzemplioriais (pvz., nuosėdomis). .arba šeimininkas-asocijuotas asmuo).Kad jis būtų plačiai prieinamas mokslo bendruomenei, šis jūrų genomo išteklius, kuriame taip pat yra neklasifikuotų fragmentų (pvz., iš prognozuojamų fagų, genominių salų ir genomo fragmentų, apie kuriuos nėra pakankamai duomenų MAG rekonstrukcijai), galima palyginti su taksonominiais duomenimis. .Prieikite prie anotacijų kartu su genų funkcija ir kontekstiniais parametrais vandenyno mikrobiologijos duomenų bazėje (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Tada mes nusprendėme ištirti biosintetinio potencialo turtingumą ir naujumą atvirų vandenynų mikrobiomuose.Šiuo tikslu pirmiausia panaudojome antiSMASH visiems MAG, SAG ir REF, aptiktiems 1038 jūrų metagenomuose (metoduose), kad iš viso būtų galima numatyti 39 055 BGC.Tada mes sugrupavome juos į 6907 nereikalingus GCF ir 151 genų klasterių populiacijas (GCC; 2 papildoma lentelė ir metodai), kad atsižvelgtume į būdingą perteklumą (ty tą patį BGC galima užkoduoti keliuose genomuose) ir metagenominius duomenis Koncentruotų BGC suskaidymas.Neužbaigti BGC reikšmingai nepadidėjo, jei tokių buvo (papildoma informacija), atitinkamai GCF ir GCC, turinčių bent vieną nepažeistą BGC narį 44% ir 86% atvejų.
Persijos įlankos bendradarbiavimo tarybos lygmeniu radome daug įvairių numatytų RiPP ir kitų natūralių produktų (2a pav.).Pavyzdžiui, arilpolienai, karotenoidai, ektoinai ir sideroforai priklauso GCC, turinčioms platų filogenetinį pasiskirstymą ir didelį vandenyno metagenomų kiekį, o tai gali reikšti platų mikroorganizmų prisitaikymą prie jūros aplinkos, įskaitant atsparumą reaktyviosioms deguonies rūšims, oksidacinis ir osmosinis stresas..arba geležies pasisavinimas (daugiau informacijos).Ši funkcinė įvairovė prieštarauja neseniai atliktai maždaug 1,2 milijono BGC analizei iš maždaug 190 000 genomų, saugomų NCBI RefSeq duomenų bazėje (BiG-FAM/RefSeq, toliau – RefSeq)29, kuri parodė, kad neribosominės sintetazės ir poliketidesintetazės peptidai (NRPS) (PKS) BGC (papildoma informacija).Taip pat radome 44 (29 %) GCC tik toli susijusius su bet kokiu RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0,4; 2a pav. ir metodai) ir 53 (35 %) GCC tik MAG , pabrėždami potencialą aptikti anksčiau neaprašytas chemines medžiagas OMD.Atsižvelgiant į tai, kad kiekvienas iš šių GCC greičiausiai atstovauja labai įvairioms biosintetinėms funkcijoms, toliau analizavome duomenis GCF lygiu, siekdami pateikti išsamesnę BGC grupavimą, kuris, kaip prognozuojama, koduos panašius natūralius produktus29.Iš viso 3861 (56 %) identifikuoti GCF nesutapdavo su RefSeq, o> 97 % GCF nebuvo MIBiG, vienoje didžiausių eksperimentiškai patvirtintų BGC duomenų bazių (2b pav.).Nors nenuostabu, kad nustatymuose, kurie nėra gerai reprezentuojami etaloninio genomo, nenuostabu atrasti daug galimų naujų būdų, mūsų metodas, skirtas BGC atkartojimui į GCF prieš atliekant lyginamąją analizę, skiriasi nuo ankstesnių ataskaitų 16 ir leidžia mums pateikti nešališką naujumo vertinimą.Didžioji dalis naujos įvairovės (3012 GCF arba 78%) atitinka prognozuojamus terpenus, RiPP ar kitus natūralius produktus, o dauguma (1815 GCF arba 47%) yra užkoduoti nežinomuose tipuose dėl jų biosintetinio potencialo.Skirtingai nei PKS ir NRPS klasteriai, šie kompaktiški BGC yra mažiau suskaidyti metagenominio surinkimo metu 31 ir leidžia daugiau laiko ir išteklių reikalaujančius funkcinius apibūdinti jų produktus.
Iš viso 39 055 BGC buvo suskirstyti į 6 907 GCF ir 151 GCC.a, duomenų atvaizdavimas (vidinis išorinis).Hierarchinis BGC atstumų grupavimas pagal GCC, iš kurių 53 nustato tik MAG.GCC yra BGC iš skirtingų taksonų (ln-transformuotų vartų dažnis) ir skirtingų BGC klasių (apskritimo dydis atitinka jo dažnį).Kiekvieno GCC išorinis sluoksnis rodo BGC skaičių, paplitimą (mėginių procentas) ir atstumą (minimalus BGC kosinuso atstumas (min (dMIBiG))) nuo BiG-FAM iki BGC.GCC, kurių BGC yra glaudžiai susiję su eksperimentiškai patikrintais BGC (MIBiG), yra paryškinti rodyklėmis.b Lyginant GCF su prognozuojamais (BiG-FAM) ir eksperimentiškai patvirtintais (MIBiG) BGC, buvo rastas 3861 naujas (d–>0,2) GCF.Dauguma (78%) iš jų koduoja RiPP, terpenus ir kitus numanomus natūralius produktus.c, visi OMD genomai, rasti 1038 jūrų metagenomuose, buvo patalpinti į GTDB bazinį medį, kad būtų parodyta filogenetinė OMD aprėptis.Kladai be jokių genomų OMD rodomi pilkai.BGC skaičius atitinka didžiausią numatomų BGC skaičių viename genome tam tikrame klade.Siekiant aiškumo, paskutiniai 15% mazgų yra sutraukti.Rodyklės rodo kladus, kuriuose gausu BGC (>15 BGC), išskyrus Mycobacterium, Gordonia (antra tik Rhodococcus) ir Crocosphaera (antra tik Synechococcus).d, Nežinomas c.Eremiobacterota parodė didžiausią biosintetinę įvairovę (Shannon indeksas, pagrįstas natūralaus produkto tipu).Kiekviena juosta reiškia genomą, turintį daugiausiai rūšių BGC.T1PKS, I tipo PKS, T2/3PKS, II tipo PKS ir III tipo.
Be turtingumo ir naujumo, mes tyrinėjame jūrų mikrobiomo biosintetinio potencialo biogeografinę struktūrą.Mėginių grupavimas pagal vidutinį metagenominį GCF kopijų skaičiaus pasiskirstymą (metodai) parodė, kad žemos platumos, paviršinėse, prokariotinėse ir neturtingose ​​virusų bendruomenėse, daugiausia iš paviršinių ar gilesnių saulės apšviestų vandenų, gausu RiPP ir BGC terpenų.Priešingai, poliarinės, giliavandenės, virusų ir dalelių turtingos bendruomenės buvo susijusios su didesniu NRPS ir PKS BGC gausumu (išplėsti duomenys, 4 pav. ir papildoma informacija).Galiausiai, mes nustatėme, kad gerai ištirtos atogrąžų ir pelaginės bendruomenės yra perspektyviausi naujų terpenų šaltiniai (papildytų duomenų paveikslas).Didžiausias PKS, RiPP ir kitų natūralių produktų potencialas (5a pav. su išplėstiniais duomenimis).
Norėdami papildyti jūrų mikrobiomų biosintetinio potencialo tyrimą, siekėme nustatyti jų filogenetinį pasiskirstymą ir nustatyti naujus BGC praturtintus kladus.Šiuo tikslu jūrinių mikrobų genomus patalpinome į normalizuotą GTDB13 bakterijų ir archeologinį filogenetinį medį ir uždengėme galimus jų koduojamus biosintezės kelius (2c pav.).Jūros vandens mėginiuose (metoduose), žinomuose dėl savo biosintetinio potencialo, pvz., cianobakterijos (Synechococcus) ir Proteus bakterijos, pvz., Tistrella32, 33, lengvai aptikome keletą BGC praturtintų kladų (atstovaujamų daugiau nei 15 BGC) arba neseniai atkreipėme dėmesį dėl jų natūralūs produktai.pvz., Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus ir Planctomycetota34,35,36.Įdomu tai, kad šiuose kladuose radome keletą anksčiau neištirtų linijų.Pavyzdžiui, tos rūšys, turinčios turtingiausią biosintetinį potencialą phyla Planctomycetota ir Myxococcota, priklausė atitinkamai neapibūdintoms kandidatų grupėms ir gentims (3 papildoma lentelė).Apskritai tai rodo, kad OMD suteikia prieigą prie anksčiau nežinomos filogenetinės informacijos, įskaitant mikroorganizmus, kurie gali būti nauji fermentų ir natūralių produktų atradimo tikslai.
Toliau apibūdinome BGC praturtintą kladą ne tik suskaičiuodami maksimalų jo narių užkoduotų BGC skaičių, bet ir įvertindami šių BGC įvairovę, kuri paaiškina skirtingų tipų natūralių kandidatų produktų dažnumą (2c pav. ir metodai). )..Mes nustatėme, kad šiame tyrime biosintetiškai įvairiausias rūšis reprezentavo specialiai sukurtos bakterinės MAG.Šios bakterijos priklauso nekultivuojamai Candidatus Eremiobacterota prieglaudai, kuri, išskyrus keletą genominių tyrimų, iš esmės lieka neištirta 37, 38.Pažymėtina, kad „apie.Eremiobacterota gentis buvo analizuojama tik antžeminėje aplinkoje39 ir nėra žinoma, kad ji apima BGC praturtintus narius.Čia atkūrėme aštuonis tos pačios rūšies MAG (nukleotidų tapatumas > 99%) 23. Todėl siūlome rūšies pavadinimą „Candidatus Eudoremicrobium malaspinii“, pavadintą nereidos (jūros nimfos) vardu, graži dovana graikų mitologijoje ir ekspedicijose.'Ka.Remiantis 13 filogenetine anotacija, E. malaspinii neturi anksčiau žinomų giminaičių žemiau sekos lygio, todėl priklauso naujai bakterijų šeimai, kurią siūlome „Ca.E. malaspinii“ kaip tipo rūšis ir „Ca.Eudormicrobiaceae“ kaip oficialų pavadinimą (papildoma informacija).Trumpa metagenominė „Ca“ rekonstrukcija.E. malaspinii genomo projektas buvo patvirtintas naudojant labai mažą įvestį, ilgai skaitomą metagenominę seką ir tikslinį vieno mėginio surinkimą (metodai) kaip vieną 9,63 Mb linijinę chromosomą su 75 kb dubliavimu.kaip vienintelė likusi dviprasmybė.
Norėdami nustatyti šios rūšies filogenetinį kontekstą, mes ieškojome 40 glaudžiai susijusių rūšių papildomuose eukariotais praturtintuose metagenominiuose mėginiuose iš Tara vandenyno ekspedicijos, atlikdami tikslinę genomo rekonstrukciją.Trumpai tariant, mes susiejome metagenominius skaitymus su genomo fragmentais, susijusiais su „Ca.E. malaspinii“ ir iškėlė hipotezę, kad padidėjęs įdarbinimo rodiklis šioje imtyje rodo kitų giminaičių buvimą (metodai).Dėl to radome 10 MAG – 19 MAG derinį, atstovaujantį penkioms rūšims iš trijų genčių naujai apibrėžtoje šeimoje (ty „Ca. Eudormicrobiaceae“).Atlikę rankinį patikrinimą ir kokybės kontrolę (išplėsti duomenys, 6 pav. ir papildoma informacija), nustatėme, kad „Ca.Eudormicrobiaceae rūšys turi didesnius genomus (8 Mb) ir turtingesnį biosintezės potencialą (14–22 BGC vienai rūšiai) nei kiti „Ca“ nariai.Clade Eremiobacterota (iki 7 BGC) (3a–c pav.).
a, penkių „Ca“ filogenetinės padėties.Eudormicrobiaceae rūšys parodė BGC turtingumą, būdingą šiame tyrime nustatytoms jūrų linijoms.Filogenetinis medis apima visą „Ca.MAG Eremiobacterota ir kitų filų nariai (genomų numeriai skliausteliuose), pateikti GTDB (89 versija), buvo naudojami evoliuciniam fonui (metodai).Tolimiausi sluoksniai atspindi klasifikacijas šeimos lygiu („Ca. Eudormicrobiaceae“ ir „Ca. Xenobiaceae“) ir klasės lygiu („Ca. Eremiobacteria“).Penkios šiame tyrime aprašytos rūšys yra pavaizduotos raidiniais ir skaitmeniniais kodais ir siūlomais dvejetainiais pavadinimais (papildoma informacija).b, gerai.Eudormicrobiaceae rūšys turi septynis bendrus BGC branduolius.BGC nebuvimas A2 klade atsirado dėl reprezentatyvaus MAG neišsamumo (3 papildoma lentelė).BGC būdingi „Ca.Amphithomicrobium“ ir „Ca.Amphithomicrobium“ (A ir B klasės) nerodomi.c, visi BGC užkoduoti kaip „Ca.Nustatyta, kad Eudoremicrobium taraoceanii yra išreikštas 623 metatranskriptomis, paimtomis iš Taros vandenynų.Ištisiniai apskritimai rodo aktyvią transkripciją.Oranžiniai apskritimai žymi log2 transformuotus raukšlių pokyčius žemiau ir virš namų tvarkymo geno ekspresijos greičio (metodai).d, santykinio gausumo kreivės (metodai), rodančios „Ca.Eudormicrobiaceae rūšys yra plačiai paplitusios daugumoje vandenynų baseinų ir visoje vandens storymėje (nuo paviršiaus iki ne mažiau kaip 4000 m gylio).Remdamiesi šiais skaičiavimais, nustatėme, kad „Ca.E. malaspinii' sudaro iki 6 % prokariotinių ląstelių giliavandenių pelaginių grūdų bendrijose.Laikėme, kad rūšis yra toje vietoje, jei ji buvo rasta bet kurioje tam tikro gylio sluoksnio dydžio dalyje.IO – Indijos vandenynas, NAO – Šiaurės Atlanto vandenynas, NPO – Šiaurės Ramusis vandenynas, RS – Raudonoji jūra, SAO – Pietų Atlanto vandenynas, SO – Pietų vandenynas, SPO – Pietų Ramusis vandenynas.
Tiriant Ca gausą ir pasiskirstymą.Eudormicrobiaceae, kuri, kaip nustatėme, vyrauja daugumoje vandenynų baseinų, taip pat ir visoje vandens storymėje (3d pav.).Vietoje jie sudaro 6% jūros mikrobų bendruomenės, todėl jie yra svarbi pasaulinio jūrų mikrobiomo dalis.Be to, mes nustatėme santykinį Ca kiekį.Eudormicrobiaceae rūšys ir jų BGC ekspresijos lygiai buvo didžiausi eukariotų prisodrintoje frakcijoje (3c pav. ir išplėstiniai duomenys, 7 pav.), o tai rodo galimą sąveiką su kietosiomis dalelėmis, įskaitant planktoną.Šis pastebėjimas šiek tiek panašus į „Ca.Eudoremicrobium BGC, kurie žinomais būdais gamina citotoksiškus natūralius produktus, gali rodyti grobuonišką elgesį (papildoma informacija ir išplėsti duomenys, 8 pav.), panašiai kaip kiti plėšrūnai, kurie specialiai gamina metabolitus, tokius kaip Myxococcus41.Ca atradimas.Eudormicrobiaceae mažiau prieinamuose (vandenyno gelmėse) arba eukariotiniuose, o ne prokariotiniuose mėginiuose gali paaiškinti, kodėl šios bakterijos ir jų netikėta BGC įvairovė lieka neaiški natūralaus maisto tyrimų kontekste.
Galiausiai siekėme eksperimentiškai patvirtinti mūsų mikrobiomu pagrįsto darbo pažadą atrasti naujus būdus, fermentus ir natūralius produktus.Yra žinoma, kad tarp skirtingų BGC klasių RiPP kelias koduoja turtingą cheminę ir funkcinę įvairovę dėl įvairių subrendusių fermentų atliktų pagrindinio peptido modifikacijų po transliacijos42.Taigi mes pasirinkome du „Ca.Eudoremicrobium' RiPP BGC (3b ir 4a-e paveikslai) yra pagrįsti tuo pačiu, kaip ir bet kuris žinomas BGC (\(\bar{d}\)MIBiG ir \(\bar{d}\)RefSeq didesnis nei 0,2) .
a–c, naujos (\(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) giliavandenių Ca rūšims būdingos RiPP biosintezės klasterio heterologinė ekspresija ir in vitro fermentiniai tyrimai.E. malaspinii“ paskatino difosforilintų produktų gamybą.c, modifikacijos, nustatytos naudojant didelės skiriamosios gebos (HR) MS/MS (suskaldymas žymimas b ir y jonais cheminėje struktūroje) ir BMR (išplėsti duomenys, 9 pav.).d, šis fosforilintas peptidas pasižymi mažu žinduolių neutrofilų elastazės mikromoliniu slopinimu, kurio nėra kontroliniame peptide ir dehidratuojančiame peptide (cheminio pašalinimo sukelta dehidratacija).Eksperimentas buvo pakartotas tris kartus su panašiais rezultatais.Pavyzdžiui, heterologinė antrojo naujojo \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) baltymų biosintezės klasterio ekspresija išaiškina keturių subrendusių fermentų, modifikuojančių 46 aminorūgščių pagrindinį peptidą, funkciją.Likučiai dažomi pagal modifikacijos vietą, numatytą HR-MS/MS, izotopų ženklinimu ir BMR analize (papildoma informacija).Brūkšninė spalva rodo, kad modifikacija įvyksta vienoje iš dviejų likučių.Paveikslas yra daugelio heterologinių konstrukcijų rinkinys, rodantis visų subrendusių fermentų aktyvumą tame pačiame branduolyje.h, pagrindinio amido N-metilinimo BMR duomenų iliustracija.Visi rezultatai parodyti fig.10 su išplėstiniais duomenimis.i, Brandaus FkbM baltymų klasterio fermento filogenetinė padėtis tarp visų FkbM domenų, rastų MIBiG 2.0 duomenų bazėje, atskleidžia šios šeimos fermentą, turintį N-metiltransferazės aktyvumą (papildoma informacija).Pateikiamos scheminės BGC (a, e), pirmtakų peptidų struktūrų (b, f) ir numanomų natūralių produktų cheminių struktūrų (c, g) diagramos.
Pirmasis RiPP kelias (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) buvo rastas tik giliavandenių rūšių „Ca.E. malaspinii“ ir peptido pirmtako kodai (4a, b pav.).Šiame brandžiame fermente mes nustatėme vieną funkcinį domeną, homologišką lantipeptido sintazės dehidratacijos domenui, kuris paprastai katalizuoja fosforilinimą ir vėlesnį 43 pašalinimą (papildoma informacija).Todėl mes prognozuojame, kad pirmtako peptido modifikacija apima tokią dviejų pakopų dehidrataciją.Tačiau naudojant tandeminę masių spektrometriją (MS/MS) ir branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopiją (BMR), identifikavome polifosforilintą tiesinį peptidą (4c pav.).Nors netikėta, radome keletą įrodymų, patvirtinančių, kad tai yra galutinis produktas: du skirtingi heterologiniai šeimininkai ir nebuvimas dehidratacijos in vitro tyrimuose, pagrindinių liekanų, mutavusių subrendusio fermento katalizinėje dehidratacijos vietoje, nustatymas.visi rekonstruoti „Ca“.E. malaspinii genomas (išplėsti duomenys, 9 pav. ir papildoma informacija) ir galiausiai – fosforilinto produkto biologinis aktyvumas, bet ne chemiškai susintetinta dehidratuota forma (4d pav.).Tiesą sakant, mes nustatėme, kad jis pasižymi mažu mikromolinės proteazės slopinamuoju aktyvumu prieš neutrofilų elastazę, panašią į kitus susijusius natūralius produktus koncentracijos diapazone (IC50 = 14,3 μM) 44 , nepaisant to, kad ekologinis vaidmuo dar turi būti išaiškintas.Remdamiesi šiais rezultatais, siūlome pavadinti kelią „fosfeptinu“.
Antrasis atvejis yra sudėtingas RiPP kelias, būdingas „Ca.Numatyta, kad Eudoremicrobium gentis (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) koduoja natūralius baltyminius produktus (4e pav.).Šie keliai yra ypač svarbūs biotechnologiškai, nes numatomas neįprastų cheminių modifikacijų tankis ir įvairovė, kurią nustato fermentai, užkoduoti santykinai trumpų BGC45.Mes nustatėme, kad šis baltymas skiriasi nuo anksčiau apibūdintų baltymų, nes jame nėra pagrindinio polikeramidų NX5N motyvo ir landornamidų lantionino kilpos 46 .Norėdami įveikti įprastų heterologinių ekspresijos modelių apribojimus, mes juos naudojome kartu su pritaikyta Microvirgula aerodenitrificans sistema, kad apibūdintume keturis subrendusius fermentus (metodus).Naudodami MS/MS, izotopų žymėjimo ir BMR derinį, aptikome šiuos subrendusius fermentus 46 aminorūgščių peptido šerdyje (4f, g pav., išplėsti duomenys, 10–12 pav. ir papildoma informacija).Tarp subrendusių fermentų apibūdinome pirmąjį FkbM O-metiltransferazės šeimos nario 47 pasirodymą RiPP kelyje ir netikėtai nustatėme, kad šis subrendęs fermentas įveda pagrindinį N-metilinimą (4h pav., i ir papildoma informacija).Nors ši modifikacija žinoma natūraliuose NRP48 produktuose, fermentinis amido jungčių N-metilinimas yra sudėtinga, bet biotechnologiškai reikšminga reakcija49, kuri iki šiol domino RiPP borozinų šeimą.Specifiškumas 50,51.Šios veiklos identifikavimas kitose fermentų ir RiPP šeimose gali atverti naujas programas ir išplėsti funkcinę baltymų įvairovę 52 bei jų cheminę įvairovę.Atsižvelgdami į nustatytas modifikacijas ir neįprastą siūlomos produkto struktūros ilgį, siūlome pavadinimą „pythonamid“.
Netikėtos enzimologijos atradimas funkciškai apibūdintoje fermentų šeimoje iliustruoja aplinkos genomikos pažadą naujiems atradimams, taip pat parodo ribotą funkcinių išvadų, pagrįstų vien sekos homologija, galimybes.Taigi, kartu su pranešimais apie nekanoninius bioaktyvius polifosforilintus RiPP, mūsų rezultatai rodo daug išteklių reikalaujančią, bet svarbią sintetinės biologijos pastangų vertę, siekiant visiškai atskleisti biocheminių junginių funkcinį turtingumą, įvairovę ir neįprastas struktūras.
Čia demonstruojame mikrobų užkoduotą biosintetinio potencialo spektrą ir jų genominį kontekstą pasauliniame jūrų mikrobiome, palengvindami būsimus tyrimus, padarydami gautus išteklius prieinamus mokslo bendruomenei (//microbiomics.io/ocean/).Mes nustatėme, kad daugumą jo filogenetinių ir funkcinių naujovių galima gauti tik rekonstruojant MAG ir SAG, ypač nepakankamai išnaudojamose mikrobų bendruomenėse, kurios galėtų paskatinti būsimas biologinės žvalgybos pastangas.Nors čia daugiausia dėmesio skirsime „Ca.Eudormicrobiaceae“ kaip giminė, ypač biosintetiškai „talentinga“, daugelis neatrastoje mikrobiotoje numatytų BGC greičiausiai koduoja anksčiau neaprašytas enzimologijas, kurios duoda junginius, turinčius aplinkos ir (arba) biotechnologiškai reikšmingų veiksmų.
Buvo įtraukti metagenominiai duomenų rinkiniai iš pagrindinių okeanografinių ir laiko eilučių tyrimų su pakankamu sekos gyliu, kad būtų maksimaliai aprėptos pasaulinės jūrų mikrobų bendruomenės vandenyno baseinuose, giliuose sluoksniuose ir laikui bėgant.Šie duomenų rinkiniai (papildoma 1 lentelė ir 1 paveikslas) apima metagenomiką iš mėginių, surinktų Taros vandenynuose (prisodrintas virusais, n = 190; praturtintas prokariotais, n = 180) 12, 22 ir BioGEOTRACES ekspedicija (n = 480).Havajų vandenyno laiko serija (HOT, n = 68), Bermudų ir Atlanto vandenyno laiko serija (BATS, n = 62)21 ir Malaspinos ekspedicija (n = 58)23.Visų metagenominių fragmentų sekos nuskaitymai buvo filtruojami dėl kokybės naudojant BBMap (v.38.71), pašalinant sekos adapterius iš skaitymų, pašalinant skaitymus, susietus su kokybės kontrolės sekomis (PhiX genomais), ir naudojant trimq=14, maq=20 atmetė prastą skaitymo kokybę, maxns = 0 ir minlength = 45. Tolesnės analizės buvo atliktos arba sujungtos su QC skaitymais, jei nurodyta (bbmerge.sh minoverlap = 16).QC rodmenys buvo normalizuoti (bbnorm.sh target = 40, minddepth = 0) prieš kuriant naudojant metaSPA (v.3.11.1 arba v.3.12, jei reikia)53.Gauti pastolių kontigtai (toliau vadinami pastoliais) galiausiai buvo filtruojami pagal ilgį (≥1 kb).
1038 metagenominiai mėginiai buvo suskirstyti į grupes ir kiekvienai mėginių grupei visų mėginių metagenominės kokybės kontrolės rodmenys buvo suderinti su kiekvieno mėginio skliausteliais atskirai, todėl buvo gautas toks poromis skliausteliuose pateiktų grupių rodmenų skaičius: Tara Marine Viruses – Enriched (190×190), Prokariotai praturtinti (180×180), BioGEOTRACES, HOT and BATS (610×610) ir Malaspina (58×58).Atvaizdavimas buvo atliktas naudojant „Burrows-Wheeler-Aligner“ (BWA) (v.0.7.17-r1188)54, kuris leidžia rodmenis suderinti su antrinėmis vietomis (naudojant vėliavėlę -a).Lygiavimas buvo filtruojamas taip, kad būtų bent 45 bazių ilgio, ≥97% tapatumo ir ≥80% nuskaitymo ilgio.Gauti BAM failai buvo apdoroti naudojant jgi_summarize_bam_contig_depths scenarijų, skirtą MetaBAT2 (v.2.12.1)55, siekiant užtikrinti kiekvienos grupės pavyzdinę ir tarpinę aprėptį.Galiausiai, skliaustai buvo sugrupuoti, siekiant padidinti jautrumą, individualiai paleidžiant MetaBAT2 visuose pavyzdžiuose su –minContig 2000 ir –maxEdges 500. Naudojame MetaBAT2 vietoj ansamblio bokserio, nes nepriklausomi bandymai parodė, kad jis yra efektyviausias pavienis boksininkas.ir 10–50 kartų greičiau nei kiti dažniausiai naudojami boksininkai57.Norint patikrinti gausos koreliacijų poveikį, atsitiktinai atrinkta metagenomikos dalis (10 kiekvienam iš dviejų Tara Ocean duomenų rinkinių, 10 BioGEOTRACES, 5 kiekvienai laiko eilutei ir 5 Malaspina) papildomai naudojo tik mėginius.Vidiniai mėginiai sugrupuojami, kad būtų gauta aprėpties informacija.(Papildoma informacija).
Į tolesnę analizę buvo įtraukti papildomi (išoriniai) genomai, būtent 830 rankiniu būdu atrinktų MAG iš Tara Oceans26 duomenų rinkinio pogrupio, 5287 SAG iš GORG20 duomenų rinkinio ir duomenys iš MAR duomenų bazės (MarDB v. 4) iš 1707 izoliuotų REF ir 682 SAG) 27. MarDB duomenų rinkiniui genomai parenkami pagal turimus metaduomenis, jei imties tipas atitinka šią reguliariąją išraišką: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] izoliuotas'.
Kiekvieno metagenominio konteinerio ir išorinių genomų kokybė buvo įvertinta naudojant CheckM (v.1.0.13) ir Anvi'o Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59.Jei „CheckM“ arba „Anvi'o“ praneša apie ≥50% užbaigtumą / užbaigtumą ir ≤10% užterštumą / pertekliškumą, išsaugokite metagenomines ląsteles ir išorinius genomus vėlesnei analizei.Tada šie balai buvo sujungti į vidutinį išsamumą (mcpl) ir vidutinį užterštumą (mctn), kad genomo kokybė būtų klasifikuojama pagal bendruomenės kriterijus60 taip: aukšta kokybė: mcpl ≥ 90 % ir mctn ≤ 5 %;gera kokybė: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, vidutinė kokybė: mcpl ≥ 50% ir mctn ≤ 10%, tinkama kokybė: mcpl ≤ 90% arba mctn ≥ 10%.Tada filtruoti genomai buvo koreliuojami su kokybės balais (Q ir Q') taip: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (padermės kintamumas)/100 + 0,5 x log[N50].(įdiegta dRep61).
Kad būtų galima atlikti lyginamąją skirtingų duomenų šaltinių ir genomo tipų (MAG, SAG ir REF) analizę, 34 799 genomai buvo panaikinti remiantis vidutiniu genomo nukleotidų tapatumu (ANI), naudojant dRep (v.2.5.4).Kartojasi)61 su 95% ANI slenksčiais28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0,95 -nc 0,2) ir vienos kopijos žymenų genai, naudojant SpecI63, užtikrinantys genomo grupavimą rūšies lygiu.Kiekvienam dRep klasteriui buvo parinktas reprezentatyvus genomas pagal aukščiau apibrėžtą maksimalų kokybės balą (Q'), kuris buvo laikomas tipišku rūšiai.
Norint įvertinti atvaizdavimo greitį, BWA (v.0.7.17-r1188, -a) buvo panaudota, kad būtų atvaizduojami visi 1038 metagenominių rodmenų rinkiniai su 34 799 genomais, esančiais OMD.Kokybės kontroliuojami skaitymai buvo atvaizduoti vieno galo režimu, o gautas lygiavimas buvo filtruojamas, kad būtų išsaugoti tik ≥ 45 bp ilgio lygiai.ir tapatybė ≥95%.Kiekvieno mėginio rodymo santykis yra procentinė rodmenų, likusių po filtravimo, dalis, padalyta iš bendro kokybės kontrolės rodmenų skaičiaus.Taikant tą patį metodą, kiekvienas iš 1038 metagenomų buvo sumažintas iki 5 milijonų intarpų (išplėsti duomenys, 1c pav.) ir suderintas su GORG SAG OMD ir visuose GEM16.Iš jūros vandens išgautų MAG kiekis GEM16 kataloge buvo nustatytas pagal metagenominių šaltinių raktinius žodžius, parenkant jūros vandens mėginius (pvz., priešingai nei jūros nuosėdos).Tiksliau, mes pasirenkame „vandens“ kaip „ekosistemos_kategoriją“, „jūrinę“ kaip „ekosistemos_tipą“, o „buveinę“ filtruojame kaip „vandenyno gelmę“, „jūrą“, „jūrų vandenyną“, „pelaginę jūrą“, „jūrų vandenį“, „Vandenynas“, „Jūros vanduo“, „Paviršinis jūros vanduo“, „Paviršinis jūros vanduo“.Dėl to buvo 5903 MAG (734 aukštos kokybės), paskirstyti 1823 OTU (žiūros čia).
Prokariotų genomai buvo taksonomiškai anotuoti naudojant GTDB-Tk (v.1.0.2)64 su numatytaisiais parametrais, skirtais GTDB r89 versijai 13. Anvi'o buvo naudojamas eukariotų genomams identifikuoti remiantis domeno numatymu ir atšaukimu ≥50%, o pertekliumi ≤ 10%.Taksonominė rūšies anotacija apibrėžiama kaip vienas iš jos reprezentacinių genomų.Išskyrus eukariotus (148 MAG), kiekvienas genomas pirmiausia buvo funkciškai anotuotas naudojant prokka (v.1.14.5)65, įvardijant visus genus, apibrėžiant „archėjos“ arba „bakterijos“ parametrus, jei reikia, o tai taip pat pranešama apie ne koduojantys genai.ir CRISPR regionai, be kitų genominių savybių.Anotuokite numatytus genus identifikuodami universalius vienos kopijos žymenų genus (uscMG) naudodami fetchMG (v.1.2)66, priskirkite ortologų grupes ir užklauskite naudodami emapper (v.2.0.1)67, pagrįstą eggNOG (v.5.0)68.KEGG duomenų bazė (paskelbta 2020 m. vasario 10 d.) 69. Paskutinis veiksmas buvo atliktas suderinant baltymus su KEGG duomenų baze naudojant DIAMOND (v.0.9.30)70 su užklausa ir temos aprėptimi ≥70%.Rezultatai buvo toliau filtruojami pagal NCBI prokariotų genomo anotacijos vamzdį71, remiantis bitų sparta ≥ 50 % didžiausio tikėtino bitų spartos (pati nuoroda).Genų sekos taip pat buvo naudojamos kaip įvestis identifikuojant BGC genome naudojant antiSMASH (v.5.1.0)72 su numatytaisiais parametrais ir skirtingais klasterių sprogimais.Visi genomai ir anotacijos buvo surinkti į OMD kartu su kontekstiniais metaduomenimis, pasiekiamais internete (//microbiomics.io/ocean/).
Panašiai kaip anksčiau aprašyti metodai12,22, mes naudojome CD-HIT (v.4.8.1), kad sugrupuotume >56,6 mln. baltymus koduojančių genų iš bakterijų ir archeologinių genomų iš OMD į 95% tapatybę ir trumpesnius genus (90% aprėptis)73 iki >17,7 milijono genų grupių.Ilgiausia seka buvo pasirinkta kaip reprezentatyvus kiekvienos genų grupės genas.Tada 1038 metagenomos buvo suderintos su> 17, 7 milijono BWA (-a) klasterio narių, o gauti BAM failai buvo filtruojami, kad būtų išsaugoti tik lygiavimai su ≥95% tapatybe ir ≥45 bazinių lygių.Normalizuoto ilgio genų gausa buvo apskaičiuota pirmiausia skaičiuojant intarpus iš geriausio unikalaus išlygiavimo, o po to neaiškių žemėlapių intarpams pridedant dalinius skaičius prie atitinkamų tikslinių genų, proporcingų jų unikalių intarpų skaičiui.
Genomai iš išplėsto OMD (su papildomais MAG iš „Ca. Eudormicrobiaceae“, žr. toliau) buvo įtraukti į mOTUs74 metagenominės analizės įrankių duomenų bazę (v.2.5.1), kad būtų sukurta išplėstinė mOTU etaloninė duomenų bazė.Iš dešimties uscMG išgyveno tik šeši vienos kopijos genomai (23 528 genomai).Išplėtus duomenų bazę, rūšių lygmeniu atsirado 4494 papildomi klasteriai.1038 metagenomos buvo analizuojamos naudojant numatytuosius mOTU parametrus (v.2).Iš viso 989 genomai, esantys 644 mOTU klasteriuose (95% REF, 5% SAG ir 99,9% priklauso MarDB), nebuvo aptikti naudojant mOTU profilį.Tai atspindi įvairius papildomus MarDB genomų jūrinės izoliacijos šaltinius (dauguma neaptiktų genomų yra susiję su organizmais, išskirtais iš nuosėdų, jūrų šeimininkais ir kt.).Norėdami ir toliau sutelkti dėmesį į atviro vandenyno aplinką šiame tyrime, mes neįtraukėme juos į paskesnę analizę, nebent jie buvo aptikti arba įtraukti į išplėstinę mOTU duomenų bazę, sukurtą šiame tyrime.
Visi BGC iš MAG, SAG ir REF OMD (žr. aukščiau) buvo sujungti su BGC, identifikuotais visuose metagenominiuose karkasuose (antiSMASH v.5.0, numatytieji parametrai) ir apibūdinti naudojant BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM domenas)75.Remdamiesi šiomis savybėmis, apskaičiavome visus kosinuso atstumus tarp BGC ir sugrupavome juos (vidutinės nuorodos) į GCF ir GCC, naudodami atitinkamai 0, 2 ir 0, 8 atstumo slenksčius.Šios slenkstinės vertės yra slenksčių, anksčiau naudotų naudojant Euklido atstumą75 kartu su kosinuso atstumu, pritaikymas, kuris sumažina kai kurias pradinės BiG-SLICE klasterizacijos strategijos (papildoma informacija) klaidas.
Tada BGC buvo filtruojami, kad ant pastolių būtų užkoduotas tik ≥5 kb, kad būtų sumažinta suskaidymo rizika, kaip aprašyta anksčiau16, ir neįtraukti MarDB REF ir SAG, kurių nėra 1038 metagenomuose (žr. aukščiau).Dėl to iš viso OMD genomas užkodavo 39 055 BGC, o dar 14 106 buvo identifikuoti metagenominiuose fragmentuose (ty nesujungti į MAG).Šie „metagenominiai“ BGC buvo naudojami įvertinti jūrų mikrobiomų biosintezės potencialo, kuris nėra užfiksuotas duomenų bazėje, dalį (papildoma informacija).Kiekvienas BGC buvo funkciškai apibūdintas pagal nuspėjamus produktų tipus, apibrėžtus anti-SMASH arba grubesnėmis produktų kategorijomis, apibrėžtomis BiG-SCAPE76.Siekiant išvengti kiekybinio atrankos paklaidų (taksonominė ir funkcinė GCC / GCF sudėtis, GCF ir GCC atstumas iki etaloninių duomenų bazių ir GCF metagenominė gausa), išlaikant tik ilgiausią kiekvienos rūšies GCF BGC, 39 055 BGC buvo toliau panaikinti. iš viso 17 689 BGC.
GCC ir GCF naujumas buvo įvertintas pagal atstumą tarp apskaičiuotos duomenų bazės (RefSeq duomenų bazė BiG-FAM)29 ir eksperimentiškai patikrintos (MIBIG 2.0)30 BGC.Kiekvienam iš 17 689 reprezentacinių BGC pasirinkome mažiausią kosinuso atstumą iki atitinkamos duomenų bazės.Tada šie minimalūs atstumai yra apskaičiuojami (vidurkis) pagal GCF arba GCC, atitinkamai.GCF laikomas nauju, jei atstumas iki duomenų bazės yra didesnis nei 0,2, o tai atitinka idealų atstumą tarp (vidutinio) GCF ir atskaitos.GCC pasirenkame 0,4, kuris yra dvigubai didesnis už GCF apibrėžtą slenkstį, kad būtų užfiksuotas ilgalaikis ryšys su nuorodomis.
BGC metagenominis gausumas buvo įvertintas kaip vidutinis jo biosintetinių genų gausumas (nustatytas anti-SMASH), gautas iš genų lygio profilių.Tada kiekvieno GCF arba GCC metagenominis gausumas buvo apskaičiuotas kaip tipinių BGC suma (iš 17 689).Vėliau šie gausos žemėlapiai buvo normalizuoti pagal ląstelių sudėtį, naudojant kiekvieno mėginio mOTU skaičių, kuris taip pat atsižvelgė į sekos nustatymo pastangas (išplėsti duomenys, 1d pav.).GCF arba GCC paplitimas buvo apskaičiuotas kaip mėginių, kurių gausa > 0, procentas.
Euklidinis atstumas tarp mėginių buvo apskaičiuotas pagal normalizuotą GCF profilį.Šie atstumai buvo sumažinti naudojant UMAP77, o gauti įterpimai buvo naudojami neprižiūrimam tankiu pagrįstam klasterizavimui naudojant HDBSCAN78.Optimalus minimalus taškų skaičius klasteriui (taigi ir klasterių skaičius), kurį naudoja HDBSCAN, nustatomas maksimaliai padidinus kaupiamąją klasterio narystės tikimybę.Nustatyti klasteriai (ir atsitiktinai subalansuota šių klasterių dalis, siekiant atsižvelgti į paklaidą permutacinėje daugiamatėje dispersijos analizėje (PERMANOVA)) buvo patikrintos dėl reikšmingumo nesumažėjusių Euklido atstumų atžvilgiu naudojant PERMANOVA.Vidutinis mėginių genomo dydis buvo apskaičiuotas remiantis santykiniu mOTU gausumu ir apskaičiuotu genomų narių genomo dydžiu.Visų pirma, vidutinis kiekvieno mOTU genomo dydis buvo įvertintas kaip jo narių genomo dydžių vidurkis, pakoreguotas siekiant išsamumo (po filtravimo) (pavyzdžiui, 75 % viso genomo, kurio ilgis 3 Mb, pakoreguotas dydis yra 4 Mb).vidutiniams genomams, kurių vientisumas ≥70%.Tada kiekvieno mėginio vidutinis genomo dydis buvo apskaičiuotas kaip mOTU genomo dydžių suma, sverta pagal santykinį gausumą.
Filtruotas genomo koduotų BGC rinkinys OMD rodomas bakterijų ir archeologiniuose GTDB medžiuose (≥5 kb rėmuose, išskyrus REF ir SAG MarDB, nerastas 1038 metagenomuose, žr. aukščiau) ir jų numatomose produktų kategorijose, remiantis filogenetine. genomo padėtis (žr. aukščiau).Pirmiausia sumažinome duomenis pagal rūšis, kaip tipišką genomą su daugiausia tos rūšies BGC.Vizualizacijai atstovai buvo toliau suskirstyti į medžių grupes ir vėl kiekvienam ląstelių kladui buvo pasirinktas genomas, turintis daugiausiai BGC.BGC praturtintos rūšys (bent vienas genomas su > 15 BGC) buvo toliau analizuojamos apskaičiuojant Šenono įvairovės indeksą tuose BGC koduotiems produktų tipams.Jei visi numatomi produktų tipai yra vienodi, cheminiai hibridai ir kiti sudėtingi BGC (kaip numatė anti-SMAH) laikomi priklausančiais tam pačiam produkto tipui, neatsižvelgiant į jų eilę klasteryje (pvz., baltymo-bakteriocino ir bakteriocino-proteoproteino suliejimo). kūnas).hibridas).
Likusi DNR (apskaičiuota, kad yra 6 ng) iš Malaspina mėginio MP1648, atitinkanti biologinį mėginį SAMN05421555 ir suderinta su Illumina SRR3962772 metagenominio skaitymo rinkiniu trumpam skaitymui, apdorota pagal PacBio sekos nustatymo protokolą su itin maža įvestimi, kad būtų galima naudoti Pacbelllification gDNA rinkinį Pacbellamplification. rinkinys (100-980-000) ir SMRTbell Express 2.0 šablonų paruošimo rinkinys (100-938-900).Trumpai tariant, likusi DNR buvo supjaustyta, pataisyta ir išgryninta (ProNex granulės), naudojant Covaris (g-TUBE, 52104).Tada išgryninta DNR yra paruošiama, amplifikuojama, išgryninama (ProNex granulės) ir dydžio parinkimas (>6 kb, Blue Pippin) prieš galutinį gryninimo etapą (ProNex granulės) ir sekvenavimą Sequel II platformoje.
Pirmųjų dviejų rekonstrukcija apie.MAG Eremiobacterota atveju nustatėme šešis papildomus ANI > 99% (jie yra įtraukti į 3 paveikslą), kurie iš pradžių buvo filtruojami pagal užteršimo balus (vėliau identifikuoti kaip genų dubliavimasis, žr. toliau).Taip pat radome padėklą su užrašu „Ca“.Eremiobacterota“ iš įvairių tyrimų23 ir naudojo juos kartu su aštuoniais MAG iš mūsų tyrimo kaip atskaitos tašką metagenominiams rodmenims iš 633 eukariotų praturtintų (>0,8 µm) mėginių, naudojant BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, – vėliavėlė) mažinant mėginius. kartografavimas (5 mln. skaitymų).Remiantis sodrinimo specifiniais žemėlapiais (filtruota pagal 95% lygiavimo tapatybę ir 80% skaitymo aprėptį), surinkimui buvo atrinkta 10 metagenomų (numatomas aprėptis ≥5×), o dar 49 metagenomų (numatomas aprėptis ≥1×) turinio koreliacijai.Naudojant tuos pačius parametrus, kaip aprašyta aukščiau, šie mėginiai buvo sudėti ir pridėta 10 papildomų „Ca“.MAG Eremiobacterota buvo atkurta.Dėl šių 16 MAG (neskaičiuojant dviejų, jau esančių duomenų bazėje) bendras genomų skaičius išplėstoje OMD yra 34 815.MAG priskiriami taksonominiai rangai, atsižvelgiant į jų genominį panašumą ir padėtį GTDB.18 MAG buvo atkartoti naudojant dRep į 5 rūšis (intraspecifinis ANI > 99%) ir 3 gentis (intragenerinis ANI nuo 85% iki 94%) toje pačioje šeimoje79.Rūšių atstovai buvo atrinkti rankiniu būdu pagal vientisumą, užterštumą ir N50.Siūloma nomenklatūra pateikta papildomoje informacijoje.
Įvertinkite „Ca“ vientisumą ir užterštumą.MAG Eremiobacterota, įvertinome uscMG buvimą, taip pat specifinius linijos ir domeno vienos kopijos žymenų genų rinkinius, kuriuos naudoja CheckM ir Anvi'o.2 dublikatai iš 40 uscMG buvo patvirtinti filogenetine rekonstrukcija (žr. toliau), kad būtų išvengta bet kokio galimo užteršimo (tai atitinka 5%, remiantis šiais 40 žymenų genų).Papildomas penkių reprezentatyvių MAG tyrimas „Ca.Žemas teršalų lygis šiuose rekonstruotuose genomuose buvo patvirtintas Eremiobacterota rūšims naudojant interaktyvią Anvi'o sąsają, pagrįstą gausos ir sekos sudėties koreliacijomis (papildoma informacija)59.
Filogenominei analizei pasirinkome penkis reprezentatyvius MAG „Ca“.Eudormicrobiaceae“, visos rūšys „Ca.Eremiobacterota ir kitų phyla narių (įskaitant UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria ir Planctomycetota) genomą galima gauti iš GTDB (r89)13.Visi šie genomai buvo anotuoti, kaip aprašyta anksčiau vienos kopijos žymeklio geno ekstrakcijai ir BGC anotacijai.GTDB genomai buvo išsaugoti pagal aukščiau nurodytus vientisumo ir užterštumo kriterijus.Filogenetinė analizė buvo atlikta naudojant Anvi'o Phylogenetics59 darbo eigą.Medis buvo sukurtas naudojant IQTREE (v.2.0.3) (numatytosios parinktys ir -bb 1000)80 ant 39 tandeminių ribosomų baltymų, nustatytų Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81.Jo pareigos buvo sumažintos.kad padengtų bent 50% genomo82, o Planctomycecota buvo naudojama kaip išorinė grupė, pagrįsta GTDB medžio topologija.Vienas 40 uscMG medis buvo pastatytas naudojant tuos pačius įrankius ir parametrus.
Naudojome Traitar (v.1.1.2) su numatytaisiais parametrais (fenotipu, iš nukleotidų)83, kad prognozuotume bendrus mikrobų bruožus.Ištyrėme galimą grobuonišką gyvenimo būdą, pagrįstą anksčiau sukurtu grobuonišku indeksu84, kuris priklauso nuo baltymą koduojančio geno kiekio genome.Tiksliau, mes naudojame DIAMOND, kad palygintume genomo baltymus su OrthoMCL duomenų baze (v.4)85, naudodami parinktis –jautresnis –id 25 –query-cover 70 –subject-cover 70 –top 20 IR suskaičiuosime genus, atitinkančius plėšrūnų ir neplėšrūnų žymenų genai.Indeksas yra skirtumas tarp grobuoniškų ir negrobuoniškų ženklų skaičiaus.Kaip papildomą kontrolę mes taip pat išanalizavome „Ca“ genomą.Entotheonella TSY118 faktorius pagrįstas jo ryšiu su Ca.Eudoremicrobium (didelis genomo dydis ir biosintezės potencialas).Toliau išbandėme galimus ryšius tarp plėšrūnų ir ne plėšrūnų žymenų genų bei Ca biosintezės potencialą.Eudormicrobiaceae“ ir nustatė, kad ne daugiau kaip vienas genas (iš bet kokio tipo žymeklio geno, ty plėšrūno / ne plėšrūno geno) sutampa su BGC, o tai rodo, kad BGC nepainioja plėšrūnų signalų.Papildoma sumaišytų replikonų genominė anotacija buvo atlikta naudojant TXSSCAN (v.1.0.2), siekiant konkrečiai ištirti sekrecijos sistemą, pilis ir flagella86.
Penki reprezentatyvūs Ca buvo suskirstyti kartografuojant 623 metatranskriptus iš Taros vandenynų prokariotinių ir eukariotinių sodrinimo frakcijų22, 40, 87 (naudojant BWA, v.0.7.17-r1188, -a vėliavėlę).Eudormicrobiaceae genomas.BAM failai buvo apdoroti naudojant FeatureCounts (v.2.0.1)88 po 80 % skaitymo aprėpties ir 95 % tapatybės filtravimo (su parinktimis featureCounts –primary -O –fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) Skaičiuoja intarpų skaičius vienam genui.Sukurti žemėlapiai buvo normalizuoti pagal genų ilgį ir žymenų genų gausą mOTU (normalizuotas pagal ilgį vidutinis įterpimų skaičius genams, kurių įterpimų skaičius >0) ir log-transformuotas iki 22,74, kad būtų gauta santykinė kiekvieno geno lygio ekspresija ląstelėje, o tai taip pat paaiškina kintamumas nuo mėginio iki mėginio sekos nustatymo metu.Tokie santykiai leidžia atlikti lyginamąją analizę, sušvelninant sudėties problemas, kai naudojami santykinio gausumo duomenys.Tik mėginiai, turintys > 5 iš 10 mOTU žymenų genų, buvo svarstomi tolesnei analizei, kad būtų galima aptikti pakankamai didelę genomo dalį.
Normalizuotas „Ca“ transkripto profilis.E. taraoceanii buvo sumažintas matmenų dydis naudojant UMAP, o gautas vaizdas buvo naudojamas neprižiūrimam klasterizavimui naudojant HDBSCAN (žr. aukščiau), siekiant nustatyti ekspresijos būseną.PERMANOVA tikrina skirtumų tarp nustatytų klasterių reikšmingumą pradinėje (nesumažintoje) atstumo erdvėje.Šių sąlygų diferencinė ekspresija buvo išbandyta visame genome (žr. aukščiau) ir buvo nustatytas 201 KEGG kelias 6 funkcinėse grupėse, būtent: BGC, sekrecijos sistema ir žiuželiniai genai iš TXSSCAN, skilimo fermentai (proteazė ir peptidazės) ir grobuoniški bei ne. grobuoniškų genų.grobuoniškų indeksų žymenys.Kiekvienam mėginiui mes apskaičiavome vidutinę normalizuotą kiekvienos klasės išraišką (atkreipkite dėmesį, kad pati BGC ekspresija apskaičiuojama kaip vidutinė to BGC biosintetinių genų ekspresija) ir patikrinta, ar jos reikšmės yra skirtingose ​​​​būsenose (Kruskal-Wallis testas, pritaikytas FDR).
Sintetiniai genai buvo įsigyti iš GenScript, o PGR pradmenys buvo įsigyti iš Microsynth.DNR amplifikacijai buvo naudojama Phusion polimerazė iš Thermo Fisher Scientific.DNR gryninimui buvo naudojamos NucleoSpin plazmidės, NucleoSpin gelis ir Macherey-Nagel PGR gryninimo rinkinys.Restrikcijos fermentai ir T4 DNR ligazė buvo įsigyti iš New England Biolabs.Chemikalai, išskyrus izopropil-β-d-1-tiogalaktopiranozidą (IPTG) (Biosynth) ir 1,4-ditiotreitolį (DTT, AppliChem), buvo įsigyti iš Sigma-Aldrich ir naudojami be tolesnio valymo.Antibiotikai chloramfenikolis (Cm), spektinomicino dihidrochloridas (Sm), ampicilinas (Amp), gentamicinas (Gt) ir karbenicilinas (Cbn) buvo įsigyti iš AppliChem.Bacto Tryptone ir Bacto Yeast Extract terpės komponentai buvo įsigyti iš BD Biosciences.Tripsinas sekos nustatymui buvo nupirktas iš Promega.
Genų sekos buvo išskirtos iš anti-SMASH prognozuojamo BGC 75.1.E. malaspinii (papildoma informacija).
Genai embA (lokusas, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (lokusas, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4) ir embAM (įskaitant tarpgeninius regionus) buvo sudaryti kaip E raiška be sintetinio konstravimo5 ir sekvenuoti kaip sintetiniai RUC7. kada.EmA genas buvo subklonuotas į pirmąją daugybinę pACYCDuet-1 (CmR) ir pCDFDuet-1 (SmR) klonavimo vietą (MCS1) su BamHI ir HindIII skilimo vietomis.EmM ir embMopt genai (optimizuoti kodonais) buvo subklonuoti į MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) su BamHI ir HindIII ir patalpinti į antrąją daugybinę pCDFDuet-1 (SmR) ir pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) klonavimo vietą. NdeI/ChoI.EmAM kasetė buvo subklonuota į pCDFDuet1 (SmR) su BamHI ir HindIII skilimo vietomis.Orf3/embI genas (lokusas, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) buvo sukurtas persidengimo išplėtimo PGR būdu, naudojant pradmenis EmbI_OE_F_NdeI ir EmbI_OE_R_XhoI, suardytas su NdeI/Xho1-D, naudojant restrikcijos pCSM1 (taip pat ir Xho1-D). fermentai (papildomas lentelė).6).Restrikcijos fermentų virškinimas ir ligavimas buvo atlikti pagal gamintojo protokolą (New England Biolabs).