310 10*1mm Nerūdijančio plieno suvyniotų vamzdžių cheminis komponentas, Spidroino N-galiniai domenai sudaro hidrogelius amiloidinių fibrilių pagrindu ir yra baltymų imobilizavimo platforma.

Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojate naršyklės versiją su ribotu CSS palaikymu.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Be to, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stilių ir JavaScript.
Slankikliai, rodantys tris straipsnius vienoje skaidrėje.Norėdami pereiti per skaidres, naudokite mygtukus „Atgal“ ir „Kitas“ arba, norėdami pereiti per kiekvieną skaidrę, naudokite skaidrių valdiklio mygtukus pabaigoje.

Specifikacija

310 10*1mm nerūdijančio plieno suvyniotų vamzdžių tiekėjai

Cheminė sudėtis

Mechaninės savybės

Rekombinantiniai vorų šilko baltymai (šilko vorų baltymai) turi daug galimų pritaikymų kuriant naujas biomedžiagas, tačiau dėl jų daugiarūšio ir agregacinio pobūdžio juos sunku gauti ir juos lengva naudoti.Čia pranešame, kad rekombinantiniai miniatiūriniai spidroino baltymai ir, svarbiausia, pats N-galinis domenas (NT) greitai sudaro savarankiškus ir skaidrius hidrogelius 37 ° C temperatūroje.sulieti baltymai, susidedantys iš NT ir žalio fluorescencinio baltymo arba purino nukleozido fosforilazės, sudaro visiškai funkcionuojančius sulietus baltymus.Hidrogeliai.Mūsų rezultatai rodo, kad rekombinantiniai NT ir sulieti baltymai užtikrina aukštą ekspresijos išeigą ir suteikia hidrogeliams patrauklias savybes, tokias kaip skaidrumas, želėjimas be kryžminio ryšio ir tiesioginis aktyvių baltymų imobilizavimas esant dideliam tankiui.
Vorai turi net septynis skirtingus šilko liaukų rinkinius, kurių kiekvienas gamina tam tikros rūšies šilką.Visos septynios šilko rūšys sudarytos iš maždaug 6000 likučių ilgio vorų šilko baltymų (spidroinų) ir turi didelį centrinį pasikartojimo regioną, apsuptą sferinių N- ir C-galinių domenų (NT ir CT)1,2.Plačiausiai ištirtą šilko tipą – pirminę ampulę – gamina pirminė ampulės liauka.Šioje liaukoje vienasluoksnis epitelio ląstelių sluoksnis sintezuoja spidroino baltymus ir išskiria juos į liaukos spindį, kur jų yra tirpioje formoje (dopingas) itin didelėmis koncentracijomis (30–50 % m/t)3,4.Buvo diskutuojama dėl pagrindinių ampulių spidroino baltymų organizavimo ir konformacijos liaukoje, tačiau dauguma eksperimentinių įrodymų rodo, kad yra paprastai spiralinė ir (arba) atsitiktinė spiralinė konformacija ir micelinės arba lamelės struktūros 5, 6, 7, 8, 9, 10.Nors pasikartojantys domenai reguliuoja šilko pluoštų mechanines savybes, sudarydami β lakštų nanokristalus ir amorfines struktūras 11, 12, 13, 14, 15, galiniai domenai reguliuoja šilko pluoštus, reaguodami į besikeičiančias sąlygas išilgai šilko liaukos .Kontroliuojant šilko susidarymą, 19. Galiniai domenai yra evoliuciškai konservuoti ir jų funkcija gali būti bendra visiems spidroino baltymams 2,20,21.Praeinant per liauką, spidroino pH sumažėja nuo maždaug 7,6 iki < 5,716 ir didėja dėl šlyties ir tempimo, kurį sąlygoja judėjimas per palaipsniui siaurėjantį lataką.Tirpale CT yra α-spiralinis konstitucinis lygiagretus dimeras17, tačiau, reaguodamas į žemą pH ir šlyties jėgas, CT išsiskleidžia ir perjungia β sluoksnius16, 17, galbūt suaktyvindamas β sluoksnius pasikartojančiose Convert 16 srityse. NT yra monomeriniai. sąlygos, atspindinčios sąlygas liaukos spindyje ir tarpininkaujančios spidroino tirpumui, tačiau esant sumažintam pH, daugelio karboksirūgšties šoninių grandinių protonavimas sukelia NT dimerizaciją, kurios pKa yra maždaug 6,5, taip stabilizuojant NT ir fiksuojant spidroiną dideliuose sluoksniuose. kiekiai.tinklai16,18.Taigi, NT vaidina pagrindinį vaidmenį formuojant gijų, keičiant iš monomero dangoje į dimerą pluošte 23, 24, 25.NT išlieka labai tirpus ir spiralinis visomis iki šiol ištirtomis sąlygomis 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, o tai paskatino jį sukurti kaip tirpumą didinančią etiketę heterologinių baltymų gamybai.
Rekombinantinis mini voro šilko baltymas, kurį sudaro vienas NT, vienas trumpas pasikartojantis regionas, vienas CT ir His6 žymė (His-NT2RepCT), skirta valyti, tirpsta vandeniniame buferyje kaip natūralus voro šilko baltymas ir imituoja svarbias natūralias šilko voro savybes. .aprėptis 25.31.His-NT2RepCT gali būti susuktas į ištisinius pluoštus naudojant biomimetinį įrenginį, kuriame pH 8 tirpi danga išspaudžiama į pH 525, 32, 33, 34, 35 vandens vonią.E. coli, ekspresuojančios His-NT2RepCT, bioreaktoriaus fermentacija ir vėlesnis apdorojimas davė >14 g/l išeigą po gryninimo.Didelis His-NT2RepCT derlius, didelis tirpumas ir tinkamas atsakas į rūgštines sąlygas yra priskiriami NT23, 25, 34.
Čia pranešame apie greitą skaidrių hidrogelių susidarymą iš rekombinantinių spidroino baltymų, įskaitant tik NT, inkubuojant baltymų tirpalą 37 ° C temperatūroje.Naudodami tioflavino T fluorescenciją (ThT), Furjė transformacijos infraraudonųjų spindulių spektroskopiją (FTIR), branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopiją (BMR) ir transmisijos elektronų mikroskopiją (TEM), nustatėme, kad NT ir mikrovorų baltymai struktūriškai transformuojasi į β lakštus ir į amiloidą panašias fibriles. kai susidaro geliai.Be to, NT ir žalio fluorescencinio baltymo (GFP) arba purino nukleozido fosforilazės (PNP) sulieti baltymai sudaro hidrogelius su visiškai funkcionuojančiais suliejimo fragmentais.Didelio našumo ekspresija heterologiniuose šeimininkuose, kartu su greitu hidrogelių susidarymu fiziologinėmis sąlygomis, atveria galimybę ekonomiškai efektyviai gaminti hidrogelius su inžinerinėmis funkcijomis.
Skirtingai nuo daugelio praneštų rekombinantinių spidroino baltymų36, His-NT2RepCT yra stabilus Tris-HCl buferyje esant 8 pH ir gali būti koncentruotas iki 500 mg/ml be nusodinimo25.Todėl nustebome, kad šis baltymas greitai suformuoja optiškai skaidrius, save laikančius hidrogelius, kai inkubuojamas 37 °C temperatūroje (1b-d pav.).Tolesni tyrimai parodė, kad His-NT2RepCT gelis pasireiškė esant plačiam baltymų koncentracijų diapazonui (10–300 mg/ml) ir kad ši koncentracija buvo atvirkščiai koreliuojama su želėjimo trukme (1c pav. ir 1 papildomas pav.).Norėdami sužinoti, kurios His-NT2RepCT dalys tarpininkauja hidrogelio susidarymui, mes ištyrėme kiekvieną domeną atskirai ir įvairiais deriniais, naudodami kolbos inversijos testą (1a, b pav.).Visos tirtos rekombinantinio spidroino frakcijos suformavo gelius (kai baltymų koncentracija 300 mg/ml) greičiau nei per 1 val., išskyrus nusodintą 2Rep (1b pav.).Tai rodo, kad vien NT ir CT, kartu arba kartu su pasikartojimais, gali sustingti 37 °C temperatūroje ir kad His6 žyma neturi reikšmingos įtakos šiam procesui.Atsižvelgiant į bendrą nuomonę, kad NT yra labai tirpus ir stabilus baltymas, ir kad ankstesniuose pranešimuose apie rekombinantinius spidroino hidrogelius geliacijos poveikis buvo priskirtas konformaciniams pokyčiams pasikartojančiuose regionuose ir (arba) CT, pats NT galėtų.Gelio atradimas buvo netikėtas.1 papildoma lentelė 37, 38, 39. Pažymėtina, kad NT jau suželė per 10 minučių, kai koncentracija ≥ 300 mg/ml (1c pav.).Buteliuko inversijos eksperimentai su įvairiomis NT koncentracijomis parodė, kad esant > 50 mg/ml, NT tirpalas želė greičiau nei His-NT2RepCT esant atitinkamai koncentracijai (m/t, 1c pav.).
Scheminis įvairių šiame darbe tirtų spidroino konstrukcijų vaizdavimas.b Įvairių rekombinantinių spidroino baltymų (300 mg/ml) gelio laikas 37 °C temperatūroje, patikrintas apverčiant buteliuką.KT gelis iš karto be inkubacijos (<300 mg/mL), 2Rep nuosėdos (300 mg/mL, 5 mm skalė).c His-NT2RepCT ir NT gelio laikas esant nurodytoms baltymų koncentracijoms 37 °C temperatūroje.d His-NT2RepCT ir NT hidrogelių nuotraukos su atitinkamai voru ir raide „NT“ (abi 200 mg/mL, skalės juosta 5 mm).
Hidrogeliai, sudaryti iš įvairių rekombinantinių spidroino baltymų, yra šiek tiek skirtingų spalvų, o stebint plika akimi matomas įvairus skaidrumo laipsnis (1b pav.).NT geliai yra išskirtinai skaidrūs, o kiti geliai tampa nepermatomi.His-NT2RepCT ir NT geliai, supilti į cilindrinius vamzdelius, gali būti išimti iš formos nepažeistus (1d pav.).
Norint patikrinti, ar natūralūs vorų šilko dangos želia tokiomis sąlygomis, kurios dabar sukelia rekombinantinių spidroino baltymų želė, dangos buvo paimtos iš Švedijos tiltinio voro (Larinioides sclopetarius) didelės ampulės liaukos.Dangos buvo laikomos 20 mM Tris-HCl buferyje 50 mg / ml (remiantis išmatuotu sausu svoriu), tačiau 21 dieną inkubuojant 37 ° C temperatūroje želė nepastebėta (papildomas 2a paveikslas).
Norint nustatyti šių gelių kiekį, galima naudoti reologinius matavimus geliacijos procesui tirti ir bendroms mechaninėms savybėms nustatyti.Visų pirma, saugojimo modulio (elastingumo) stebėjimas aukštesnėje temperatūroje gali suteikti informacijos apie želė stingimo temperatūrą ir dangos klampumo savybes.Temperatūros kilimo eksperimentai (naudojant 1 °C/min 25–45 °C temperatūroje, remiantis ankstesniais tyrimais, naudojant natūralaus šilko pradinius tirpalus)40,41 parodė, kad His-NT2RepCT ir NT tirpalų laikymo moduliai didėja didėjant temperatūrai .buvo padidintas (2 pav. ir papildomas 3 pav.).Pažymėtina, kad NT modulis pradėjo augti žemesnėje temperatūroje, palyginti su His-NT2RepCT, o tai atitinka greitesnį gelio laiką, pastebėtą, kai NT buvo tiesiogiai inkubuojamas su His-NT2RepCT 37 ° C temperatūroje (1 pav.).Vėliau nukritus temperatūrai, saugojimo modulis negrįžo į žemesnes vertes ir išliko virš nuostolių modulio (žr. papildomą 3 pav.), rodantį termiškai negrįžtamą stabilų geliavimą.Po geliavimo galutinis elastingumo modulis svyravo nuo 15 iki 330 kPa His-NT2RepCT hidrogeliams esant 100–500 mg/ml koncentracijai, o galutinis elastingumo modulis NT hidrogeliams (100–500 mg/mL) svyravo nuo 2 iki 1400 kPa (pav. , 2 ir visi rampos duomenys) žr. papildomą 3 pav.).
a Temperatūros pokytis matuojant His-NT2RepCT (300 mg/mL) ir b NT (300 mg/mL) kratant.Rodyklės rodo temperatūros tendenciją, o šviesesnis saugojimo modulio duomenų atspalvis rodo bandymą esant mažesnėms prietaiso sukimo momento vertėms, nei nurodė gamintojas, o tai ir yra padidėjusio triukšmo priežastis.c His-NT2RepCT ir NT kaupimasis galiniame modulyje po aukštesnės temperatūros (100, 300 ir 500 mg/ml).Visi modulio rodmenys imami 0,1 Hz dažniu.
Kaip galimą metodą su geliacija susijusiems konformaciniams pokyčiams tirti, užfiksavome His-NT2RepCT ir NT FTIR spektrus prieš ir po geliacijos 37 °C temperatūroje (3a, b pav.).Kaip ir tikėtasi, His-NT2RepCT ir NT tirpalų spektrai atitiko baltymus, turinčius α-spiralės / atsitiktinės ritės antrinę struktūrą su ryškia juosta ties 1645 cm-1.Dėl abiejų hidrogelių geliavimo susidarė dvi rankos vidurinėje I juostoje maždaug 1617 cm-1 ir 1695 cm-1 (3a, b pav.), o tai rodo antilygiagrečių β lakštų struktūrų susidarymą.Šie pokyčiai taip pat gali būti aiškiai matomi atitinkamuose antrųjų darinių ir skirtumų geliacijos spektruose (papildomas 4b pav.).Dvi NT β sluoksnio juostos buvo ryškesnės nei His-NT2RepCT, o tai rodo, kad bendras β sluoksnio juostų kiekis NT hidrogelyje buvo didesnis nei NT2RepCT hidrogelio.
His-NT2RepCT ir b NT (abu 500 mg/ml) FTIR absorbcijos spektrai prieš (tirpalas) ir po (gelis) inkubacijos 37 °C temperatūroje.c Resuspenduotų 50 mg/ml NT2RepCT gelių ir d NT TEM vaizdai.Mastelio juosta 200 nm.e His-NT2RepCT ir NT hidrogelių skaidulų skersmenys.n = 100 išmatuotų fibrilių, p < 0,0001.Klaidų juostos rodo standartinį nuokrypį.Klaidų juostų centras yra vidurkis.Statistinei analizei buvo naudojamas nesuporuotas t testas (dviejų uodegų).f Įvairių rekombinantinių spidroino baltymų (100 mg/ml) ThT fluorescencija 37 °C temperatūroje nekratant.g NT (100 mg/mL) inokuliacijos eksperimentai iš 100 mg/mL NT gelio su 0%, 5%, 10% ir 20% sėklų.
Gelio analizė naudojant transmisijos elektronų mikroskopiją (TEM) parodė, kad hidrogelis susideda iš į amiloidą panašių fibrilių (3c, 3d pav.).NT suformuotos fibrilės buvo pailgos (5–12 nm skersmens) ir nešakotos, o His-NT2RepCT fibrilės buvo trumpesnio ilgio ir žymiai platesnio skersmens (7–16 nm) (3e pav.).Šie rezultatai leido mums stebėti fibrozės kinetiką naudojant tioflavino T (ThT) tyrimą.Visų rekombinantinių spidroino baltymų fluorescencinis signalas padidėjo, kai mėginiai buvo inkubuojami 37 °C temperatūroje (3f pav., papildomas 5a pav.).Remiantis šia išvada, mikroskopinis NT ir His-NT2RepCT tyrimas gelio sąlygomis atskleidė vienodą ThT fluorescencijos padidėjimą be pastebimo vietinio ThT teigiamų agregatų kaupimosi (papildomas 5b, c pav.).ThT teigiamų fibrilių susidarymo nepadidino NT ir His-NTCT drumstumas (papildomas 5d pav.), o tai reiškia, kad fibrilių tinklas gelyje gali susidaryti nepakenkiant gelio skaidrumui.Sėjimas, pridedant nedidelį kiekį iš anksto suformuotų fibrilių, gali žymiai pagreitinti kai kurių amiloidų fibrilių susidarymą42, 43, 44, tačiau į NT hidrokoaguliantų tirpalą pridedant 5 %, 10 % arba 20 % (m/m) NT.sėjimo efektas (3g pav.).Galbūt taip yra dėl to, kad hidrogelio fibrilės yra gana fiksuotos ir negali būti naudojamos kaip sėklos.
Netikėtas rekombinantinių spidroino baltymų elgesys aukštoje temperatūroje paskatino tolesnius branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) spektroskopijos tyrimus, siekiant nustatyti konformacinius pokyčius, susijusius su gelio susidarymu.His-NT2RepCT tirpalų BMR spektrai, užregistruoti laikui bėgant 37 °C temperatūroje, parodė, kad CT vis dar buvo iš dalies sulankstytas, o NT ir 2Rep signalai išnyko (4a pav.), o tai rodo, kad daugiausia NT ir 2Rep iš dalies kontroliavo His. NT2RepCT hidrogelis.CT signalas taip pat buvo susilpnintas iki 20% pradinio intensyvumo, o tai rodo, kad CT taip pat dažniausiai yra fiksuotas ir įtrauktas į hidrogelio struktūrą.Mažesnei KT daliai, kuri yra tokia pat judri kaip ir iš anksto inkubuotame mėginyje ir todėl stebima tirpalo BMR, spektruose trūksta signalų pirmiesiems 10 struktūrinių liekanų, galbūt dėl ​​​​to, kad sunku imobilizuoti pritvirtintą His-NT2Rep dalį.Hidrogelių -NT2RepCT būsenos BMR spektrai atskleidė vyraujantį α-spiralių ir β-sluoksnių buvimą ir, kiek mažesniu mastu, atsitiktinę ritės konformaciją (4b pav.).Metionino likučių, esančių tik NT, cheminė poslinkio analizė parodė, kad šis domenas buvo paverstas β lakšto struktūra.Nuo laiko priklausomi NT spektrai tirpale rodė tolygų signalo intensyvumo mažėjimą (4c pav.), o NT hidrogelių kietojo kūno BMR parodė, kad dauguma NT liekanų pavirto į β lakšto struktūras (4d pav.).2Rep konformacija negalėjo būti nustatyta atskirai dėl jos tendencijos agreguotis.Tačiau NTCT ir His-NT2RepCT hidrogelių kietojo kūno BMR spektrai atrodė labai panašūs (4b pav.; papildomas 6b pav.), o tai rodo, kad 2Rep mažai prisidėjo prie His-NT2RepCT hidrogelio struktūrinės dalies.Nustatyta, kad KT hidrogeliams egzistuoja α-spiralės, β-lapai ir atsitiktinės spiralinės antrinės struktūros (papildomas 6d pav.).Tai rodo, kad kai kurios KT dalys išlieka α-spiralės, o kitos tampa β-lapais.Taigi, BMR spektroskopijos rezultatai rodo, kad NT yra svarbus hidrogelio susidarymui ir taip pat virsta β lakšto konformacija susiliejus su 2Rep ir CT.Atsižvelgiant į tai, neseniai nustatėme, kad amiloidiniai erdviniai užtrauktukai greičiausiai susidaro visose penkiose NT domeno spiralėse, o Waltz algoritmas numatė amiloidogeninį regioną 1 spirale (4e pav.).
15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT tirpalo 2D spektrai prieš (mėlyna) ir 19 valandų po inkubacijos (raudona) 37°C temperatūroje.Atskiros kryžminės smailės raudoname spektre ir F24, G136, poliA mėlyname spektre žymimos vienos raidės aminorūgščių simboliais ir liekanų skaičiais.Įdėklai rodo signalo intensyvumo priklausomybę nuo laiko pasirinktoms liekanoms iš NT, 2Rep ir CT domenų.b His-NT2RepCT hidrogelių kietojo kūno radijo dažnio (RFDR) spektrai.Cα/Cβ likučių koreliacijos, pastebėtos RFDR spektruose, buvo nustatytos palyginus su modelio peptidų cheminiais poslinkiais ir reikšmėmis, gautomis iš statistikos82,83 ir jų antrinių struktūrų.SSB – besisukanti šoninė juosta.c 15N-HSQC 10 mg/mL NT tirpalo vienmačiai spektrai inkubuojant 37 °C temperatūroje 36 valandas.Įdėklas rodo tūrinį intensyvumą, palyginti su laiku.d NT hidrogelių kietojo kūno RFDR spektrai.Nurodytos RFDR spektruose pastebėtos Cα/Cβ liekanų ir jų antrinių struktūrų koreliacijos.e Remiantis NT45.79 fibriliacijos polinkio profiliu iš Zipper duomenų bazės (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Heksapeptido erdvinio žaibo poslinkio lango Rosetta energija rodoma kcal/mol.Raudonos juostos žymi heksapeptidus, turinčius didelį polinkį į fibrozę (Rosetta energija mažesnė nei -23 kcal/mol; žemiau punktyrinės linijos).Žalios juostos rodo fragmentus, kurių Rosetta energija viršija slenkstį, todėl mažesnė tikimybė, kad susidarys steriški užtrauktukai.Fragmentai, kuriuose yra prolino, nebuvo įtraukti į analizę (be stulpelių).Kvadratai rodo amiloidozės sritis, kurias numatė Waltz algoritmas81 (https://waltz.switchlab.org).NT aminorūgščių liekanų seka yra viršuje, o likučių tipai, rasti antrinėje β struktūroje (nustatomi kietojo kūno BMR spektroskopija), rodomi raudonai.Penkių NT α-spiralių padėtys žymimos (H1-H5)28.
Esant pH <6,5, HT dimerizuojasi ir yra atsparus karščio arba karbamido sukeltai denatūracijai18.Norint išsiaiškinti, kaip NT dimerizacija ir stabilumas veikia želė, tirpalai, kuriuose yra 100 mg/ml NT, buvo kontroliuojami esant pH 8, 7 ir 6, naudojant buteliuko apvertimo testą.NT mėginiai, inkubuoti esant pH 8 ir 7, sustingo po 30 min. 37 °C temperatūroje, tačiau pH 8 gelis liko skaidrus, o pH 7 gelyje buvo matomos nuosėdos (5a pav.).Priešingai, tirpalas, kurio pH yra 6, nesudarė gelio, o po 20 minučių 37 ° C temperatūroje buvo matomos didelės nuosėdos.Tai rodo, kad patys dimerai ir (arba) jų didesnis stabilumas, palyginti su monomerais, neleidžia želėti.NT nuosėdų susidarymo esant pH 7 ir 6 nesitikėta, nes buvo pranešta, kad NT tirpsta esant 200 mg/ml27, po terminio denatūravimo lengvai susilanksto ir taip pat išlaiko α-spiralę esant mažesnėms pH 18. Tikėtinas šių neatitikimų paaiškinimas yra tas, kad anksčiau aprašyti eksperimentai buvo atlikti kambario temperatūroje arba žemesnėje temperatūroje arba esant santykinai žemai baltymų koncentracijai16,18,19.
NT buteliuko apvertimo testas (100 mg/mL) esant pH 8, 7, 6 ir 154 mM NaCl (pH 8) po inkubacijos 37°C temperatūroje.b NT CD spektrai su ir be 154 mM NaF ir 154 mM NaCl, atitinkamai.Molinė elipsė ties 222 nm paverčiama natūralių raukšlių dalimi.c NT inversijos tyrimas (100 mg/ml) NT* (37 °C ir 60 °C), NTA72R (37 °C) ir His-NT-L6 (37 °C ir 60 °C).d NT mutantų NT*, NTA72R ir His-NT-L6 CD spektrai.Molinė elipsė ties 222 nm paverčiama natūralių raukšlių dalimi.e NTFlSp, NTMiSp ir redukuoto NTMiSp (100 mg/mL) inversijos testas.Mastelio juosta 5 mm.f NT, NTFlSp, NTMiSp ir redukuoto NTMiSp CD spektrai.Molinė elipsė ties 222 nm paverčiama natūralių raukšlių dalimi.Visi NT spektrai 25 ° C ir 95 ° C temperatūroje parodyti 8 papildomame paveikslėlyje.
Fiziologinė druskos koncentracija lemia elektrostatinę sąveiką tarp NT subvienetų ir NT perdavimo dimerizaciją iki žemesnio pH18.Mes nustatėme, kad 154 mM NaCl ir NaF iš tiesų atitinkamai slopino želėjimą (5a, b pav.; papildomas 2b pav.) ir kad šios druskos padidino NT monomerų terminį stabilumą (5b pav., 8 papildomas pav.). .Tai taip pat rodo, kad stabilumo didinimas, o ne dimerizacija, neleidžia susidaryti geliui.
Norėdami toliau tirti baltymų dimerizacijos ir stabilumo vaidmenį geliacijoje, naudojome du mutantus, NT * ir NTA72R, kurie taip pat išlieka monomeriniai esant žemam pH 28, 30.NT* yra dvigubo krūvio atvirkštinis mutantas, kuriame matomas monomero dipolinio krūvio pasiskirstymas yra išlygintas, o tai neleidžia dimerizuotis ir drastiškai padidina monomero stabilumą.NTA72R yra įkrautas dipolis, tačiau Arg pakeistas Ala yra ties dimero riba, todėl mutacijos trukdo subvienetų sąveikai, reikalingai dimerizacijai.Inkubuojant 37 °C temperatūroje, NT* nesudarė hidrogelio, o NTA72R 15 min sudarė nepermatomą gelį (5c pav.).Kadangi tiek NT*, tiek NTA72R negali dimerizuotis, bet skiriasi monomero stabilumu (5d pav.), šie rezultatai aiškiai rodo, kad didelis termodinaminis stabilumas neleidžia NT želėti.Tai patvirtina ir faktas, kad HT* suformuoja gelį, kai yra nestabilus aukštoje temperatūroje (po 8 min. esant 60°C; 5c pav.).Anksčiau buvo įrodyta, kad didelis metionino kiekis NT suskystina jo natūralų sulankstymą ir kad šeši Met ir Leu pakaitalai (čia vadinami His-NT-L6) stipriai stabilizuoja NT46 monomerą.Remdamiesi prielaida, kad NT gelio susidarymui reikalingas struktūrinis lankstumas, mes nustatėme, kad His-NT-L6 stabilus mutantas nesustingo 37 ° C temperatūroje (5c, d pav.).Tačiau His-NT-L6 taip pat sudarė gelį inkubuojant 60 °С temperatūroje 60 minučių (5c pav.).
Atrodo, kad NT gebėjimas transformuotis į β lakštų struktūras ir sudaryti hidrogelius taikomas kai kuriems, bet ne visiems spidroino NT domenams.NT iš skirtingų šilko tipų ir vorų rūšių, Trichonephila clavipes (NTFlSp), sudarė gelius, nepaisant santykinai mažo metionino kiekio ir didelio terminio stabilumo (5e, f pav. ir 2 papildoma lentelė).Priešingai, NT iš mažo ampulinio baltymo spidroino iš Araneus ventricosus (NTMiSp) su mažu terminiu stabilumu ir dideliu metionino kiekiu nesudarė hidrogelių (2 papildoma lentelė ir 5e, f pav.).Pastarasis gali būti susijęs su intramolekulinėmis disulfidinėmis jungtimis 29, 47.Nuosekliai, kai NTMiSp disulfidiniai ryšiai buvo redukuoti, po 10 minučių inkubacijos 37 °C temperatūroje susidaro hidrogelis (5e pav.).Apibendrinant, reikia pažymėti, kad struktūrinis lankstumas yra svarbus, bet ne vienintelis kriterijus formuojant gelį iš NT.Kitas veiksnys, kuris gali būti svarbus, yra polinkis formuoti amiloidines fibriles, o analizė su užtrauktuko duomenų baze ir Waltz algoritmu parodė ryšį tarp gebėjimo formuoti gelius ir amiloidogeninių sričių buvimo, taip pat prognozuojamų regionų masto. suformuoti sterinius užtrauktukus.Buvo koreliacija (2 papildoma lentelė ir 9 papildomas pav.).
NT gebėjimas sudaryti fibriles ir formuoti gelius palankiomis sąlygomis leido mums daryti prielaidą, kad NT susiliejimas su kitais baltymų fragmentais vis tiek gali sudaryti gelius, turinčius visas sintezės partnerių funkcijas.Norėdami tai patikrinti, NT C gale atitinkamai įvedėme žalią fluorescencinį baltymą (GFP) ir purino nukleozido fosforilazę (PNP).Gauti sulieti baltymai buvo ekspresuojami E. coli su labai dideliu galutiniu derliumi (atitinkamai 150 mg/l ir 256 mg/l kratomos kolbos kultūros His-NT-GFP ir His-NT-PNP), atitinka tai, kas buvo parodyta. kitiems baltymams, sujungtiems su NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) ir His-NT-PNP (100mg/mL) sulieti baltymai po 2 valandų ir 6,5 valandos 37°C temperatūroje suformavo gelius ir, svarbiausia, GFP frakcija išliko nepakitusi.stebimas po geliacijos, kai > 70 % pradinio fluorescencijos intensyvumo liko po geliacijos (6a pav.).Norėdami išmatuoti PNP aktyvumą his-NT-PNP tirpaluose ir geliuose, sulietą baltymą turėjome atskiesti NT, nes gryno preparato fermentinis aktyvumas buvo už tyrimo aptikimo diapazono esant želiuojančioms koncentracijoms.Gelis, sudarytas iš mišinio, kuriame yra 0,01 mg/ml His-NT-PNP ir 100 mg/mL NT, išlaikė 65% pradinio fermentinio aktyvumo iš anksto inkubuotuose mėginiuose (6b pav.).Gelis matavimo metu liko nepažeistas (papildomas 10 pav.).
Santykinis fluorescencijos intensyvumas prieš ir po His-NT-GFP (300 mg/ml) ir apversto buteliuko, kuriame yra His-NT-GFP hidrogelio (300 mg/ml) gelio, želė matomoje ir UV šviesoje.Taškai rodo atskirus matavimus (n = 3), klaidų juostos rodo standartinį nuokrypį.Vidutinė vertė rodoma klaidų juostų centre.b PNP aktyvumas buvo gautas atliekant fluorometrinę analizę, naudojant tirpalus ir gelius, sudarytus iš NT (100 mg/ml) ir mišinio, kuriame yra 0,01 mg/ml his-NT-PNP ir 100 mg/ml Naujojo Taivano dolerių.Įdėkle pavaizduotas apverstas buteliukas su hidrogeliu, kuriame yra His-NT-PNP (5 mm skalės juosta).
Čia mes pranešame apie hidrogelių susidarymą iš NT ir kitų rekombinantinių spidroino baltymų, inkubuojant baltymų tirpalą 37 ° C temperatūroje (1 pav.).Parodome, kad geliacija yra susijusi su α-spiralių transformacija į β-sluoksnius ir į amiloidą panašių fibrilių susidarymu (3 ir 4 pav.).Šis atradimas stebina, nes NT yra susukti rutuliniai penkių spiralių pluoštai, žinomi dėl ypač didelio tirpumo ir didelio stabilumo, kai koncentracija > 200 mg/mL 4 °C temperatūroje keletą dienų27.Be to, NT lengvai susilanksto po terminio denatūravimo, kai baltymų koncentracija yra maža µM.Remiantis mūsų rezultatais, fibrilių susidarymui reikalingas >10 mg/mL baltymų koncentracijos ir šiek tiek padidintos temperatūros derinys (1 pav.).Tai atitinka idėją, kad amiloidinės fibrilės gali susidaryti iš rutuliškai sulankstytų baltymų, kurie dėl šiluminių svyravimų fiziologinėmis sąlygomis yra iš dalies išsiskleidę 48 .Baltymų, kuriems vyksta ši konversija, pavyzdžiai yra insulinas49,50, β2-mikroglobulinas, transtiretinas ir lizocimas51,52,53.Nors NT yra α-spiralė savo prigimtinėje būsenoje, maždaug 65 % polipeptidinės grandinės yra suderinama su sterinio užtrauktuko formavimu (4e pav.) 45 .Kadangi monomeras yra dinamiškai mobilus46, jis gali atskleisti šiuos potencialius amiloidogeninius regionus esant vidutiniškai aukštai temperatūrai, o esant didelėms bendrojo baltymo koncentracijoms, jis gali pasiekti kritinę amiloido fibrilių susidarymo koncentraciją54.Remdamiesi šiais samprotavimais, nustatėme neigiamą koreliaciją tarp spidroino koncentracijos ir gelio susidarymo laiko (1c pav.), o jei monomerinė NT konformacija stabilizuojama mutacijomis (NT*, His-NT-L6) arba pridėjus druskos, tai gali užkirsti kelią susidaro hidrogeliai (5 pav.).
Daugeliu atvejų amiloidinės fibrilės išnyksta iš tirpalo kaip nuosėdos, tačiau tam tikromis sąlygomis jos gali sudaryti hidrogelius55,56,57.Hidrogelį formuojančios fibrilės paprastai turi didelį kraštinių santykį ir sudaro stabilius trimačius tinklus per molekulinį susipynimą, 55, 58 atitinka mūsų rezultatus.Norint susidaryti hidrogeliui in vitro, baltymai dažnai visiškai arba iš dalies išsiskleidžia, pavyzdžiui, veikiant organiniams tirpikliams, aukštai temperatūrai (70–90 °C) ir (arba) žemam pH (1,5–3,0)59, 60, 61, 62.Čia aprašyti spidroino hidrogeliai nereikalauja griežto apdorojimo, taip pat jiems nereikia kryžminių jungčių, kad būtų stabilizuoti hidrogeliai.
Anksčiau buvo pranešta, kad spidroino pasikartojimai ir QD, kurie, atrodo, šilko verpimo metu keičiasi β lakštais, sudaro hidrogelius.Palyginti su mūsų išvadomis, inkubacijos laikas ir (arba) inkubavimo temperatūra buvo atitinkamai ilgesni arba aukštesni, o gauti hidrogeliai dažnai buvo nepermatomi (7 pav. ir 1 papildoma lentelė) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Be greito stingimo laiko, NT hidrogeliai >300 mg/mL (30 %) pranoko visus kitus aprašytus rekombinantinius vorų šilko baltymų hidrogelius, taip pat natūralius hidrogelius, tokius kaip želatina, alginatas (2 %), agaras (0,5 %). ) ir kolageno.(0,6 %) (7 pav. ir 1 bei 3 papildomos lentelės)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Šiame tyrime hidrogelių gelio laikas ir elastingumo modulis buvo lyginami su kitais spidroino pagrindu pagamintais hidrogeliais ir pasirinktais natūraliais hidrogeliais.Nuorodos pateikiamos kartu su geliacijos sąlygų aprašymu.APS Amonio persulfatas, kambario temperatūra.37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 duomenys.
Panašu, kad vorai sukūrė būdus, kaip saugoti spidroiną nuo želė.Nepaisant didelės baltymų koncentracijos šilko liaukoje, didelis pasikartojimo regionas, susijęs su galiniu domenu, reiškia, kad tariama NT ir CT koncentracija liaukoje atitinka maždaug 10-20 mg/ml šio tyrimo ribose.reikalingas in vitro stebimam hidrogelio susidarymui.Be to, panašios koncentracijos druskų 16 stabilizavo NT, kaip ir šilko liaukose (5b pav.).NT konformacija buvo ištirta E. coli citozolyje ir nustatyta, kad ji glaudžiau susilanksčiusi nei tiriant in vitro, o tai dar labiau rodo, kad druska ar kiti veiksniai neleidžia jai agreguotis in vivo.Tačiau NT gebėjimas transformuotis į β lakštų fibriles gali būti svarbus gijų formavimuisi ir turėtų būti ištirtas atliekant būsimus tyrimus.
Be naujų šiame tyrime pastebėtų į NT-amiloidą panašių fibrilių ir hidrogelio susidarymo aspektų, mes taip pat parodome, kad šis reiškinys gali būti pritaikytas biotechnologiniais ir biomedicininiais tikslais (8 pav.).Kaip koncepcijos įrodymą, mes sujungėme NT su GFP arba PNP ir parodėme, kad sulietas baltymas taip pat sudaro hidrogelius, kai inkubuojamas 37 ° C temperatūroje, ir kad GFP ir PNP frakcijos iš esmės išlaiko savo aktyvumą po geliavimo (6 pav.).Nukleozidų fosforilazės yra svarbūs nukleozidų analogų sintezės katalizatoriai75, todėl mūsų atradimas yra svarbus biofarmacijos pramonei.Sulietų baltymų, kurie palankiomis sąlygomis sudaro skaidrius hidrogelius, ekspresijos koncepcija leidžia sukurti funkcionalizuotus hidrogelius, pasižyminčius palankiomis savybėmis įvairiems tikslams, pavyzdžiui, fermentų imobilizavimui, kontroliuojamam vaistų išsiskyrimui ir audinių inžinerijai.Be to, NT ir NT* yra veiksmingi ekspresijos žymenys30, o tai reiškia, kad NT ir jo variantai gali būti naudojami didelio našumo tirpių sulietų baltymų gamybai ir vėliau imobilizuotų tikslinių baltymų kūrimui 3D hidrogeliuose.
NT yra tirpus, α-spiralinis ir stabilus esant mažoms koncentracijoms (µM) ir 37°C temperatūroje.Esant tokiai pačiai temperatūrai, bet didėjant koncentracijai (>10 mg/ml), NT formuoja gelius, susidedančius iš į amiloidą panašių fibrilių.NT sulieti baltymai taip pat sudaro fibrilinius gelius su visiškai funkcionuojančiais suliejimo fragmentais, leidžiančius įvairius baltymus imobilizuoti 3D hidrogeliuose naudojant NT.Apačioje: NT (PDB: 4FBS) ir skaidulinių tinklų bei susijusių baltymų struktūrų iliustracijos (manoma ir nenubrėžta pagal mastelį, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdpdbR).
Konstrukcijos (žr. 4 papildomą lentelę, kurioje pateikiamas visas sąrašas, įskaitant aminorūgščių sekas) buvo klonuotos į plazmidę pT7 ir transformuotos į E. coli BL21 (DE3).E. coli, turinčios modifikuotų plazmidžių, buvo pasėtos į Luria sultinį, papildytą kanamicinu (70 mg/l), ir auginamos per naktį 30 °C temperatūroje ir 250 aps./min.Tada kultūra buvo pasėta 1/100 į LB terpę, kurioje yra kanamicino, ir kultivuojama 30 °C temperatūroje ir 110 aps./min., kol OD600 pasiekė 0,8.BMR tyrimams bakterijos buvo auginamos M9 minimalioje terpėje, kurioje yra 2 g D-gliukozės 13C (Aldrich) ir 1 g amonio chlorido 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.), kad būtų galima ženklinti baltymus izotopais.Sumažinkite temperatūrą iki 20 laipsnių Celsijaus ir sukelkite baltymų ekspresiją 0,15 mM izopropiltiogalaktopiranozidu (galutinė koncentracija).Po nakties baltymų ekspresijos ląstelės buvo surinktos 7278 × g, 4 ° C temperatūroje 20 minučių.Ląstelių granulės buvo resuspenduotos 20 mM Tris-HCl, pH 8, ir užšaldytos iki tolesnio naudojimo.Atšildytos ląstelės buvo lizuojamos naudojant ląstelių ardiklį (TS serijos mašinos, Constant Systems Limited, Anglija) esant 30 kPa.Tada lizatai buvo centrifuguojami 25 000 g 30 minučių 4 ° C temperatūroje.NTMiSp nuosėdos buvo resuspenduojamos 2 M karbamido, 20 mM Tris-HCl, pH 8, ir 2 minutes apdorojamos ultragarsu (2 s įjungimas / išjungimas, 65%), tada vėl centrifuguojamas 25 000 xg, 4 ° C temperatūroje. 30 min.Supernatantas buvo įkeltas į Ni-NTA kolonėlę, plaunamas 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazolo, pH 8, ir galiausiai baltymas buvo išplautas 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazolo, pH 8. Norint sukurti NT2RepCT ir NTCT, trombino virškinimas įveda vietą (ThrCleav) tarp His ir NT.Trombino skilimo vietos taip pat yra His-NT-ThrCleav-2Rep (gamina 2Rep), His-tioredoksino-ThrCleav-NT (gamina NT), His-tioredoksino-ThrCleav-CT (gamina CT), His-tioredoksino-NT-ThrCleav. .* (gamina NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (gamina NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (gamina NTF1Sp) ir His-Sieros redoksino-ThrCleav-NTMiSp (gamina NTMiSp).Konstrukcijos buvo virškinamos trombinu (1:1000) ir per naktį 4 °C temperatūroje dializuojamos 20 mM Tris-HCl, pH 8, naudojant Spectra/Por dializės membraną, kurios molekulinės masės slenkstis yra 6-8 kDa.Po dializės tirpalas įpilamas į Ni-NTA kolonėlę ir surenkamas nuotėkis, kuriame yra dominantis baltymas.Baltymų koncentracija buvo nustatyta matuojant UV absorbciją esant 280 nm, naudojant kiekvieno baltymo ekstinkcijos koeficientą, išskyrus NTF1Sp, kuris naudojo Bradfordo testą pagal gamintojo protokolą.Grynumas buvo nustatytas SDS poliakrilamido (4–20%) gelio elektroforeze ir Coomassie briliantiškai mėlynu dažymu.Baltymai buvo koncentruoti naudojant centrifuginius filtrus (VivaSpin 20, GE Healthcare) esant 4000 xg su 10 kDa molekulinės masės riba 20 minučių ciklais.
Atšildykite baltymų tirpalą ir atsargiai pipete įpilkite 150 µl į 1 ml skaidrų pertvaros buteliuką (8 x 40 mm Thermo Scientific).Vamzdžiai buvo uždengti ir užsandarinti parafilmu, kad būtų išvengta išgaravimo.Mėginiai (n = 3) buvo inkubuojami 37 ° C arba 60 ° C temperatūroje ir periodiškai apverčiami, kad būtų galima stebėti želėjimą.Mėginiai, kurie nesustingo, buvo inkubuojami mažiausiai vieną savaitę.Sumažinkite NTMiSp disulfidinius ryšius naudodami 10 mM DTT 10 µM baltymo.Natūralių vorų šilko dangų geliavimuisi išanalizuoti Švedijos tiltinis voras buvo nupjautas, dvi pagrindinės ampuliuotos liaukos patalpintos į 200 μl 20 mM Tris-HCl buferio pH 8 ir perpjautos, kad danga atsiskirtų nuo liaukų..Liaukų turinys ištirpinamas buferyje, 50 µl sausos masės nustatymui (atvirus buteliukus inkubuojant 60 °C temperatūroje iki pastovios masės) ir 150 µl geliacijai 37 °C temperatūroje.
Matavimo geometrija/įrankis pagamintas iš nerūdijančio plieno, naudojant lygiagrečią plokštę, kurios viršutinis skersmuo 20 mm ir tarpas 0,5 mm.Kaitinkite mėginį nuo 25 °C iki 45 °C ir vėl iki 25 °C 1 °C per minutę greičiu, naudodami nerūdijančio plieno dugną Peltier plokštę.Vibracijos matavimai buvo atlikti 0,1 Hz dažniu ir linijinėje viskoelastinėje medžiagos srityje, esant 5% ir 0,5% deformacijai, atitinkamai 100 mg/mL ir 300–500 mg/mL mėginiams.Norėdami išvengti išgaravimo, naudokite pritaikytą drėgmės kamerą.Duomenys buvo analizuojami naudojant Prism 9.
Infraraudonųjų (IR) spektrų surinkimui kambario temperatūroje nuo 800 iki 3900 cm–1.ATR įrenginys, taip pat šviesos kelias per spektrometrą, prieš eksperimentą ir jo metu išvalomi sausu filtruotu oru.Tirpalai (500 mg / ml, siekiant sumažinti vandens absorbcijos smailes spektruose) buvo pipete pilami ant kristalų, o prieš matavimą buvo suformuoti geliai (500 mg / ml), o tada perkelti į kristalus (n = 3).Buvo įrašyta 1000 nuskaitymų su 2 cm-1 skiriamąja geba ir nuliniu darbo ciklu 2. Antroji išvestinė buvo apskaičiuota naudojant OPUS (Bruker), naudojant devynių taškų išlyginimo diapazoną.Spektrai buvo normalizuoti į tą pačią integracijos sritį tarp 1720 ir 1580 cm-1 naudojant F. Menges „Spectragryph – Optical Spectroscopy Software“.Atliekant ATR-IR spektroskopiją, infraraudonųjų spindulių pluošto įsiskverbimo į mėginį gylis priklauso nuo bangų skaičiaus, todėl esant mažesniam bangų skaičiui sugertis yra stipresnė nei esant didesniam bangų skaičiui.Šie efektai nebuvo pataisyti pagal spektrus, parodytus Fig.3, nes jie yra labai maži (papildomas 4 pav.).Pataisyti šio skaičiaus spektrai buvo apskaičiuoti naudojant Bruker OPUS programinę įrangą.
Iš esmės visapusiškas baltymų konformacijų kiekybinis įvertinimas yra įmanomas patikimai išskaidžius komponentus amido I smailėje.Tačiau praktikoje iškyla tam tikrų kliūčių.Dekonvoliucijos metu spektro triukšmas gali pasirodyti kaip (klaidingi) smailės.Be to, smailė dėl vandens lenkimo sutampa su amido I smailės padėtimi ir gali būti panašaus dydžio mėginiams, kuriuose yra daug vandens, pavyzdžiui, čia tiriamo vandeninio gelio.Todėl mes nebandėme visiškai suskaidyti amido I smailės, o mūsų stebėjimai turėtų būti vertinami tik remiant kitus metodus, tokius kaip BMR spektroskopija.
50 mg/ml NT ir His-NT2RepCT tirpalai buvo želė per naktį 37 °C temperatūroje.Tada hidrogelis buvo praskiedžiamas 20 mM Tris-HCl (pH 8) iki 12,5 mg/ml koncentracijos, gerai sukratytas ir pipete sulaužytas gelis.Tada hidrogelis buvo 10 kartų praskiestas 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl mėginio buvo uždėta ant vario tinklelio, padengto formvaru, o mėginio perteklius pašalintas blotingo popieriumi.Mėginiai du kartus plaunami 5 µl MilliQ vandens ir 5 minutes dažomi 1% uranilo formiatu.Dėmių perteklių pašalinkite sugeriančiu popieriumi, tada tinklelį išdžiovinkite oru.Vaizdai buvo atlikti šiuose tinkluose naudojant FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN, veikiantį 100 kV.Vaizdai buvo įrašyti x 26 500 ir x 43 000 padidinimu naudojant Veleta 2k × 2k CCD kamerą (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Miunsteris, Vokietija).Kiekvienam mėginiui (n = 1) buvo įrašyta 10–15 vaizdų.ImageJ (//imagej.nih.gov/) buvo naudojamas vaizdų analizei ir pluošto skersmenų matavimui (n = 100, skirtingi pluoštai).Prizmė 9 buvo naudojama nesuporuotiems t testams (dviejų uodegų) atlikti.Vidutinės His-NT2RepCT ir NT fibrilės buvo atitinkamai 11,43 (SD 2,035) ir 7,67 (SD 1,389) nm.Pasitikėjimo intervalas (95 %) yra nuo -4,246 iki -3,275.laisvės laipsniai = 198, p < 0,0001.
80 µl skystų mėginių, kuriuose yra 10 µM tioflavino T (ThT), buvo išmatuoti trimis egzemplioriais (n = 3) statinėmis sąlygomis, naudojant Corning 96 šulinėlių juodo dugno skaidraus dugno plokšteles (Corning Glass 3881, JAV).Fluorescenciniai skirtumai buvo užfiksuoti naudojant 440 nm sužadinimo filtrą ir 480 nm emisijos filtrą (FLUOStar Galaxy iš BMG Labtech, Offenburg, Vokietija).ThT signalas nebuvo nei prisotintas, nei užgesintas, nes eksperimentai su skirtingomis ThT koncentracijomis buvo atlikti nekeičiant signalo intensyvumo.Užregistruokite absorbciją esant 360 nm, kad būtų galima matuoti miglotumą.Sėjimo eksperimentams 100 mg/ml geliai buvo suformuoti 37°C temperatūroje, resuspenduojami ir naudojami sėjimui esant 5%, 10% ir 20% moliniams santykiams.Duomenys buvo analizuojami naudojant Prism 9.
His-NT2RepCT ir NT >100 mg/mL atsargas atšildykite ant ledo ir filtruokite per 0,22 µm filtrą.Koncentracijos buvo apskaičiuotos matuojant absorbciją esant 280 nm naudojant Nanodrop.96 šulinėlių juodos nepririšančios plokštelės (Corning) su skaidriu dugnu šuliniuose mėginiai buvo atskiesti iki 20 mg/ml 20 mM Tris-HCl pH 8 ir sumaišyti su 5 μM ThT (galutinė koncentracija), bendra mėginio koncentracija. 50 μl tūrio.Mėginiai buvo vaizduojami kas 10 minučių 37 ° C temperatūroje „CellObserver“ (Zeiss) mikroskopu su perduodamos šviesos kanalu ir FITC sužadinimo ir emisijos filtrų rinkiniais ThT vaizdavimui.Vaizdams gaminti naudojamas 20x/0,4 objektyvas.Vaizdo analizei buvo naudojami „Zen Blue“ („Zeiss“) ir „ImageJ“ (//imagej.nih.gov/).Geliai taip pat buvo paruošti iš NT ir His-NT2RepCT tirpalų, kurių koncentracija yra 50 mg/ml, kuriuose yra 20 mM Tris pH 8 ir 5 µM ThT, ir inkubuojami 37 °C temperatūroje 90 min.Gelio gabalėliai buvo perkelti į naują šulinėlį, kuriame yra 20 mM Tris, pH 8 ir 5 μM ThT, nesurišančioje juodoje 96 šulinėlių skaidrioje dugno plokštelėje.Įsigykite žalios fluorescencijos ir ryškaus lauko vaizdus 20x/0,4 padidinimu.Vaizdo analizei buvo naudojamas ImageJ.
Tirpalo BMR spektrai buvo gauti esant 310 K, naudojant 600 MHz Bruker Avance Neo spektrometrą, aprūpintą QCI kvadrupolio rezonanso impulsinio gradiento lauko kriozondu (HFCN).BMR mėginiai, kuriuose yra 10 mg/ml homogeninio baltymo, paženklinto 13C, 15N, ištirpinto 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02 % (m/t) NaN3, 5 % DO (v/v), (n = 1) .Cheminiai NT2RepCT poslinkiai esant pH 6,7 buvo naudojami 23 smailei priskirti 2D 15N-HSQC spektre.
13C, 15N pažymėtų hidrogelių magiško kampo besisukančio kietojo BMR (MAS) spektrai buvo užregistruoti Bruker Avance III HD spektrometru 800 MHz dažniu su 3,2 mm 13C/15N{1H} beelektroniniu zondu.Mėginio temperatūra buvo kontroliuojama naudojant kintamos temperatūros dujų srautą esant 277 K. Dvimačiai dipolio sukimosi rezonanso (DARR)76 ir radijo dažnio pakartotinio sujungimo (RFDR)77 spektrai buvo gauti atitinkamai 12,5 kHz ir 20 kHz MAS dažniais.Kryžminė poliarizacija (CP) nuo 1H iki 13C buvo atlikta naudojant linijinę rampą nuo 60,0 iki 48,0 kHz esant 1H, 61,3/71,6 kHz esant 13°C (esant 12,5/20 kHz MAS) ir kontakto trukmę 0,5–1 ms.Duomenų rinkimo metu buvo naudojamas Spinal6478 atsiejimas esant 73, 5 kHz.Gavimo laikas buvo 10 milisekundžių, o ciklo delsa buvo 2,5 sekundės.Vienkartinės Cα/Cβ koreliacijos, pastebėtos RFDR spektruose, buvo priskirtos remiantis būdingais likučių tipo cheminiais poslinkiais ir daugybinėmis koreliacijomis DARR spektruose.
Zipper79 duomenų bazė (//services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) buvo naudojama NT, NTFlSp ir NTMiSp plazdėjimo tendencijoms ir Rosetta energijai įvertinti.„Zipper“ duomenų bazė apskaičiuoja „Rosetta Energy80“, kuri sujungia keletą laisvos energijos funkcijų, kad modeliuotų ir analizuotų baltymų struktūrą.Energijos lygis -23 kcal/mol ar mažesnis rodo didelį polinkį virpėti.Mažesnė energija reiškia didesnį dviejų β-sruogų stabilumą užtrauktuko konformacijoje.Be to, Waltz algoritmas buvo naudojamas prognozuoti amiloidogeninius regionus NT, NTFlSp ir NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT baltymų tirpalas buvo sumaišytas su 2-(N-morfolino)etansulfonrūgšties (MES) buferiu, esant pH 5,5 ir 6,0, kad pH būtų sumažintas atitinkamai iki 6 ir 7.Galutinė baltymų koncentracija buvo 100 mg/ml.
Matavimai buvo atlikti J-1500 CD spektrometru (JASCO, JAV), naudojant 300 μL kiuvetę, kurios optinis kelias yra 0, 1 cm.Baltymai buvo atskiesti iki 10 μM (n = 1) 20 mM fosfatiniame buferyje (pH 8).Norint išanalizuoti baltymų stabilumą esant druskai, baltymai buvo analizuojami esant tokiai pačiai koncentracijai (n = 1) 20 mM fosfatiniame buferyje (pH 8), turinčiame atitinkamai 154 mM NaF arba NaCl.Temperatūros nuskaitymai buvo užfiksuoti esant 222 nm nuo 25 ° C iki 95 ° C, kai šildymo greitis buvo 1 ° C / min.Natūraliai sulankstytų baltymų dalis buvo apskaičiuota naudojant formulę (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Be to, kiekvienam mėginiui buvo užregistruoti penki spektrai nuo 260 nm iki 190 nm 25 ° C temperatūroje ir po kaitinimo iki 95 ° C.Penki spektrai buvo apskaičiuoti, išlyginti ir konvertuoti į molinę elipsę.Duomenys buvo analizuojami naudojant Prism 9.
His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µL) fluorescencijos intensyvumas buvo matuojamas trimis egzemplioriais (n = 3) 96 šulinėlių Corning plokštelėse su juodu permatomu dugnu (Corning Glass 3881, JAV) statinėmis sąlygomis.Išmatuokite mėginius fluorescenciniu plokšteliniu skaitytuvu, kurio sužadinimo bangos ilgis yra 395 nm, ir užregistruokite spinduliuotę esant 509 nm prieš geliavimą ir po 2 valandų 37 °C temperatūroje.Duomenys buvo analizuojami naudojant Prism 9.
Purino nukleozido fosforilazės aktyvumo tyrimo rinkinys (fluorometrinis metodas, Sigma Aldrich) buvo naudojamas pagal gamintojo instrukcijas.Norėdami išmatuoti gelių ir tirpalų, kurių sudėtyje yra His-NT-PNP, aktyvumą, sumaišykite 10 ng His-NT-PNP su 100 mg/mL NT iki bendro 2 µL tūrio, nes gelis davė signalą, viršijantį rinkinio aptikimo intervalą.Buvo įtraukti gelių ir tirpalų be His-NT-PNP kontrolė.Matavimai buvo atlikti du kartus (n = 2).Išmatavus aktyvumą, reakcijos mišinys buvo pašalintas ir gelis nufotografuotas, siekiant užtikrinti, kad gelis matavimo metu išliktų nepakitęs.Duomenys buvo analizuojami naudojant Prism 9.
Daugiau informacijos apie studijų planavimą rasite gamtos studijų santraukoje, susietoje su šiuo straipsniu.
1 ir 2 paveiksluose pateikti pradiniai duomenys.1c, 2a – c, 3a, b, e – g, 4, 5b, d, f ir 6, papildomi pav.3, papildomas pav.5a, d, papildomas pav.6 ir papildomas pav.8. Duomenys Šio tyrimo duomenys patalpinti Zenodo duomenų bazėje https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Šio tyrimo metu gauti BMR duomenys buvo paskelbti BMRBig saugykloje įrašo ID bmrbig36.GFP ir PNP struktūros buvo paimtos iš PBP (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. ir Johansson, J. Verpti dirbtinį vorų šilką.Nacionalinė chemija.biologija.11, 309–315 (2015).
Babb, PL ir kt.Nephila clavipes genomas pabrėžia vorų šilko genų įvairovę ir sudėtingą jų raišką.Nacionalinė Genette.49, 895–903 (2017).