347 12,7 * 1,24 mm Nerūdijančio plieno suvynioti vamzdeliai, sinchroninio elektrostatinio kondensacijos ir α-sinukleino ir tau koagregacijos molekulinis mechanizmas

Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojate naršyklės versiją su ribotu CSS palaikymu.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Be to, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stilių ir JavaScript.
Slankikliai, rodantys tris straipsnius vienoje skaidrėje.Norėdami pereiti per skaidres, naudokite mygtukus „Atgal“ ir „Kitas“ arba, norėdami pereiti per kiekvieną skaidrę, naudokite skaidrių valdiklio mygtukus pabaigoje.

347 nerūdijančio plieno vamzdžių specifikacija

347 12,7*1,24 mm nerūdijančio plieno suvynioti vamzdžiai

Išorinis skersmuo: 6,00 mm OD iki 914,4 mm OD, Dydžiai iki 24 colių NB Galimas iš anksto, OD dydis Plieniniai vamzdžiai yra iš anksto

SS 347 vamzdžių storio diapazonas: 0,3–50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S ir kt. (0,5–12 mm) Arba nestandartinis dydis, kurį reikia pritaikyti pagal poreikį

Tipas: SS 347 besiūliai vamzdžiai |SS 347 ERW vamzdžiai |SS 347 suvirinti vamzdžiai |SS 347 pagaminti vamzdžiai |SS 347 CDW vamzdžiai, LSAW vamzdžiai / siūlės suvirinti / perbraižyti

Forma: SS 347 apvalūs vamzdžiai / vamzdeliai, SS 347 kvadratiniai vamzdžiai / vamzdeliai, SS 347 stačiakampiai vamzdžiai / vamzdeliai, SS 347 suvynioti vamzdžiai, SS 347 "U" forma, SS 347 keptuvės ritės, SS 347 hidrauliniai vamzdžiai

Ilgis: vienas atsitiktinis, dvigubas atsitiktinis ir būtinas ilgio galas: paprastas galas, nuožulnus galas, protektorius

Galų apsauga: plastikiniai dangteliai |Išorinė apdaila: 2B, Nr.4, Nr.1, Nr.8 Veidrodinė apdaila nerūdijančio plieno vamzdžiams, apdaila pagal kliento reikalavimus

Pristatymo būklė: atkaitintas ir marinuotas, poliruotas, atkaitintas ryškiai, šaltai temptas

Patikra, bandymų ataskaitos: malūno bandymo sertifikatai, EN 10204 3.1, cheminių medžiagų ataskaitos, mechaninės ataskaitos, PMI bandymų ataskaitos, vizualinės patikros ataskaitos, trečiųjų šalių patikrinimų ataskaitos, NABL patvirtintos laboratorijos ataskaitos, ardomųjų bandymų ataskaita, neardomųjų bandymų ataskaitos

Pakavimas: supakuotas į medines dėžes, plastikinius maišelius, supakuotas plienines juosteles arba pagal klientų pageidavimus

Specialūs pasiūlymai: pagal užsakymą galima pagaminti ir kitokių dydžių ir specifikacijų

SS 347 vamzdžių dydžių diapazonas: 1/2 colio NB, OD iki 24 colių

ASTM A312 347: besiūliai ir tiesia siūle suvirinti austenitiniai vamzdžiai, skirti aukštai temperatūrai ir bendrai korozijai.Suvirinimo metu negalima naudoti užpildo metalo.

ASTM A358 347: elektra lydytas suvirintas austenitinis vamzdis, skirtas korozijai ir (arba) aukštai temperatūrai.Paprastai pagal šią specifikaciją gaminami tik iki 8 colių vamzdžiai.Suvirinimo metu leidžiama pridėti metalo užpildo.

ASTM A790 347: besiūliai ir tiesia siūle suvirinti feritiniai/austenitiniai (dvipusiai) vamzdžiai, skirti bendram korozijos naudojimui, ypatingą dėmesį skiriant atsparumui įtempių korozijos įtrūkimams.

ASTM A409 347: Tiesios arba spiralinės siūlės elektrinis suvirintas didelio skersmens 14–30 colių austenitinis šviesos sienelių vamzdis su sienelėmis Sch5S ir Sch 10S, skirtas korozijai ir (arba) aukštai

ASTM A376 347: besiūliai austenitiniai vamzdžiai, skirti naudoti aukštoje temperatūroje.

ASTM A813 347: Vienos siūlės, vieno arba dvigubo suvirinimo austenitiniai vamzdžiai, skirti aukštai temperatūrai ir bendrai korozijai.

ASTM A814 347: šaltai apdorotas suvirintas austenitinis vamzdis, skirtas aukštai temperatūrai ir bendrai korozijai.

347H nerūdijančio plieno vamzdžių cheminė sudėtis

Nerūdijančio plieno 347H vamzdžių mechaninės savybės

Nerūdijančio plieno 347H vamzdžių fizinės savybės

Lygiavertės klasės 347H nerūdijančio plieno vamzdžiams

Amiloido alfa-sinukleino (αS) agregacija yra Parkinsono ligos ir kitų sinukleinopatijų požymis.Neseniai tau baltymas, dažniausiai susijęs su Alzheimerio liga, buvo siejamas su αS patologija ir nustatyta, kad jis kartu lokalizuojasi αS turinčiuose inkliuzuose, nors molekulinis dviejų baltymų koagregacijos mechanizmas lieka neaiškus.Čia pranešame, kad αS fazė išsiskiria į skystus kondensatus per elektrostatinį kompleksinį kondensaciją su teigiamai įkrautais polipeptidais, tokiais kaip tau.Priklausomai nuo αS afiniteto polikatijonams ir koaguliacijos tinklo valentinės išeikvojimo greičio, krešuliai greitai želuoja arba susilieja, po to lėta amiloido agregacija.Sujungę pažangių biofizinių metodų rinkinį, galėjome apibūdinti skysčio ir skysčio αS / Tau fazės atskyrimą ir nustatyti pagrindinius veiksnius, dėl kurių susidaro nevienalyčiai agregatai, kuriuose yra abu baltymai skystame baltymų kondensate.
Be membranų skyrių, erdvės atskyrimas ląstelėse taip pat gali būti pasiektas formuojant baltymų turtingus, skystus panašius tankius kūnus, vadinamus biomolekuliniais kondensatais arba lašeliais, naudojant procesą, vadinamą skysčio ir skysčio fazės atskyrimu (LLPS).Šie lašeliai susidaro dėl daugiavalenčių laikinų sąveikų, dažniausiai tarp baltymų arba baltymų ir RNR, ir atlieka įvairias funkcijas beveik visose gyvose sistemose.Daugybė LLP galinčių baltymų turi mažo sudėtingumo sekas, kurios yra labai netvarkingos ir formuojasi biomolekuliniuose kondensatuose 3, 4, 5.Daugybė eksperimentinių tyrimų atskleidė lanksčią, dažnai netvarkingą ir daugiavalentę baltymų, sudarančių šiuos į skystį panašius kondensatus, prigimtį, nors mažai žinoma apie specifinius molekulinius determinantus, kurie kontroliuoja šių kondensatų augimą ir brendimą iki kietesnio pavidalo. valstybė..
Nauji duomenys patvirtina hipotezę, kad nenormalus baltymų sukeltas LLPS ir lašelių pavertimas kietomis struktūromis gali būti svarbūs ląstelių keliai, dėl kurių susidaro netirpūs toksiški agregatai, kurie dažnai yra degeneracinių ligų požymiai.Daugelis su LLPS susijusių iš esmės netvarkingų baltymų (IDP), dažnai labai įkrautų ir lankstūs, jau seniai buvo susiję su neurodegeneracija amiloido agregacijos proceso metu.Konkrečiai, buvo įrodyta, kad biomolekuliniai IDP kondensatai, tokie kaip FUS7 arba TDP-438, arba baltymai su dideliais mažo sudėtingumo domenais, tokie kaip hnRNPA19, per procesą, vadinamą skystinimu, sensta į gelio pavidalo ar net kietas formas.junginys.į kietosios fazės perėjimą (LSPT) kaip laiko funkciją arba reaguojant į tam tikras potransliacines modifikacijas ar patologiškai reikšmingas mutacijas1,7.
Kitas IDP, susijęs su LLPS in vivo, yra Tau, su mikrotubuliais susijęs sutrikęs baltymas, kurio amiloido agregacija buvo susijusi su Alzheimerio liga10, bet neseniai taip pat buvo susijusi su Parkinsono liga (PD) ir kitomis sinapsinėmis branduolinėmis proteinopatijomis 11, 12, 13.Įrodyta, kad dėl palankios elektrostatinės sąveikos Tau spontaniškai atsiskiria nuo tirpalo / citoplazmos14, todėl susidaro tau praturtinti lašeliai, žinomi kaip elektrostatiniai koacervatai.Taip pat pastebėta, kad tokio tipo nespecifinė sąveika yra daugelio gamtoje esančių biomolekulinių kondensatų varomoji jėga15.Tau baltymo atveju elektrostatinė agregacija gali būti suformuota paprastos agregacijos būdu, kai priešingai įkrautos baltymo sritys sukelia skilimo procesą, arba sudėtinga agregacija sąveikaujant su neigiamo krūvio polimerais, tokiais kaip RNR.
Neseniai ląstelių ir gyvūnų modeliuose 19, 20 buvo įrodytas α-sinukleinas (αS), amiloidinis IDP, susijęs su PD ir kitomis neurodegeneracinėmis ligomis, bendrai žinomas kaip sinukleinopatija 17, 18, koncentruotas baltymų kondensatuose, panašiuose į skysčius.In vitro tyrimai parodė, kad αS patiria LLPS paprasčiausiai agreguojant per daugiausia hidrofobines sąveikas, nors šiam procesui reikia išskirtinai didelės baltymų koncentracijos ir netipiškai ilgo inkubavimo laiko 19, 21.Nesvarbu, ar in vivo stebimi αS turintys kondensatai susidaro dėl šio ar kitų LLPS procesų, išlieka pagrindinė neišspręsta problema.Panašiai, nors αS amiloido agregacija buvo pastebėta neuronuose sergant PD ir kitomis sinukleinopatijomis, tikslus mechanizmas, kuriuo αS vyksta tarpląstelinėje amiloidinėje agregacijoje, lieka neaiškus, nes neatrodo, kad per didelė šio baltymo ekspresija savaime suaktyvintų šį procesą.Dažnai reikalingas papildomas ląstelių pažeidimas, o tai rodo, kad tam tikros ląstelių vietos arba mikroaplinka reikalingos tarpląsteliniams αS amiloidų rinkiniams atkurti.Viena ląstelių aplinka, kuri yra ypač linkusi agreguotis, gali būti baltymų kondensatų vidus 23 .
Įdomu tai, kad αS ir tau kartu lokalizuojasi būdinguose ligos inkliuzuose žmonėms, sergantiems Parkinsono liga ir kitomis sinukleinopatijomis 24, 25, o eksperimentai parodė sinergetinį patologinį ryšį tarp dviejų baltymų 26, 27, o tai rodo galimą ryšį tarp αS ir agregacijos. tau sergant neurodegeneracinėmis ligomis.liga.Nustatyta, kad αS ir tau sąveikauja ir skatina vienas kito agregaciją in vitro ir in vivo 28, 29 , o iš šių dviejų baltymų sudaryti nevienalyčiai agregatai buvo pastebėti pacientų, sergančių sinukleinopatija 30 , smegenyse.Tačiau mažai žinoma apie αS ir tau sąveikos molekulinį pagrindą ir jo bendros agregacijos mechanizmą.Buvo pranešta, kad αS sąveikauja su tau per elektrostatinį trauką tarp labai neigiamai įkrautos αS C-galinės srities ir centrinės prolino turtingos tau srities, kuri taip pat yra praturtinta teigiamai įkrautomis liekanomis.
Šiame tyrime parodome, kad αS iš tiesų gali išsiskirti į lašelius per elektrostatinį kompleksinį kondensaciją esant tau baltymui, priešingai nei jo sąveika su kitais teigiamai įkrautais polipeptidais, tokiais kaip poli-L-lizinas (pLK), ir šiame procese .αS veikia kaip pastolių molekulė lašelių tinklui.Mes nustatėme pastebimus elektrostatinių αS koacervatų brendimo proceso skirtumus, kurie yra susiję su baltymų, dalyvaujančių koacervato tinkle, sąveikos valentingumo ir stiprumo skirtumais.Įdomu tai, kad mes stebėjome αS ir tau amiloidinių baltymų koagregaciją ilgaamžiuose skystuose koacervatuose ir nustatėme kai kuriuos pagrindinius veiksnius, lemiančius šių dviejų baltymų koagregaciją tokiuose koacervatuose.Čia mes išsamiai aprašome šį procesą, kuris yra galimas molekulinis mechanizmas, kuriuo grindžiamas dviejų baltymų kolokalizavimas ligai būdinguose inkliuzuose.
αS turi labai anijoninę C-galinę uodegą esant neutraliam pH (1a pav.), ir mes manėme, kad jis gali patirti LLPS kondensuojant elektrostatinius kompleksus su polikatijoninėmis netvarkingomis polipeptidų molekulėmis.Mes naudojome 100 liekanų poli-L-liziną (pLK) kaip pradinę modelio molekulę dėl jos teigiamai įkrautos ir netvarkingos polimerinės prigimties, esant neutraliam pH 32. Pirma, patvirtinome, kad pLK sąveikauja su αS Ct domenu per tirpalo BMR spektroskopiją. (1b pav.), naudojant 13C/15N pažymėtą αS, esant didėjančiam αS:pLK moliniam santykiui.PLK sąveika su αS Ct domenu pasireiškia cheminio poslinkio perturbacijomis ir smailės intensyvumo sumažėjimu šioje baltymo srityje.Įdomu tai, kad kai sumaišėme αS su pLK, kai αS koncentracija yra maždaug.5–25 µM, esant polietilenglikoliui (5–15 % PEG-8) (tipinis LLPS buferis: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15 % PEG-8), iš karto išgyvenome platų baltymų susidarymo lauką .lašeliai buvo stebimi naudojant fluorescencinę (WF) ir šviesaus lauko (BF) mikroskopiją (1c pav.).1–5 µm lašeliai, kuriuose yra koncentruoto αS (pridėta 1 µM AlexaFluor488 pažymėto αS, AF488-αS), jų elektrostatinės savybės gali būti išvestos iš jų atsparumo 10% 1,6-heksandioliui (1,6-HD) ir jautrumo NaCl koncentracijos padidėjimas (1c pav.).αS/pLK elektrostatinio komplekso koacervatų į skystį panašumą įrodo jų gebėjimas susilieti per milisekundes (1d pav.).Naudodami turbidimetriją, kiekybiškai įvertinome lašelių susidarymą tokiomis sąlygomis, patvirtinome pagrindinės sąveikos, susijusios su jos stabilumu, elektrostatinį pobūdį (1e pav.) ir įvertinome įvairių polimerų santykių įtaką LLPS procesui (1f pav.).Nors lašelių susidarymas stebimas įvairiuose polimerų santykiuose, procesas yra labai palankus, kai pLK viršija αS.LLP taip pat buvo stebimos naudojant chemiškai skirtingą išstumiamąjį agentą dekstraną-70 (70 kDa) arba naudojant įvairius mėginių formatus, įskaitant stiklinius stiklelių lašus, įvairių medžiagų mikroplokštelių šulinukus, Eppendorfo ar kvarco kapiliarus.
Šiame tyrime naudojamų WT-αS ir ΔCt-αS variantų skirtingų baltymų regionų schema.Amfipatinis N-galinis domenas, hidrofobinis amiloidą formuojantis (NAC) regionas ir neigiamai įkrautas C-galo domenas yra atitinkamai parodyti mėlyna, oranžine ir raudona spalvomis.Rodomas WT-αS grynojo mokesčio už likutinį (NCPR) žemėlapis.b αS/pLK sąveikos BMR analizė, kai nėra stambiamolekulinių gumulėlių.Didėjant pLK koncentracijai (αS:pLK moliniai santykiai 1:0,5, 1:1,5 ir 1:10 rodomi atitinkamai šviesiai žalia, žalia ir tamsiai žalia spalva).c Koacervuokite αS/pLK (molinis santykis 1:10) esant 25 µM (1 µM AF488 pažymėtas αS arba Atto647N pažymėtas pLK WF vaizdavimui) LLPS buferyje (viršuje) arba papildytas 500 mM NaCl (apačioje kairėje) arba po jo. % 1,6-heksandiolis (1,6-HD; apačioje dešinėje).Mastelio juosta = 20 µm.d Reprezentatyvūs mikroskopiniai αS/pLK BF lašelių susiliejimo vaizdai (molinis santykis 1:10), kai koncentracija 25 μM;rodyklės rodo atskirų lašų (raudonos ir geltonos rodyklės) susiliejimą į naują lašą (oranžinė rodyklė) per 200 ms) .Mastelio juosta = 20 µm.e Šviesos sklaida (esant 350 nm) αS/pLK agregacija LLPS buferyje prieš ir po 500 mM NaCl arba 10 % 1,6-HD pridėjimo esant 25 µM αS (N = 3 mėginio pakartojimai, taip pat nurodytas vidurkis ir standartinis nuokrypis).f BF vaizdas (viršuje) ir šviesos sklaidos analizė (esant 350 nm, apačioje) αS/pLK agregacija esant 25 μM αS, didėjant αS:pLK moliniam santykiui (N = 3 mėginio pakartojimai, taip pat nurodytas vidurkis ir standartinis nuokrypis).Mastelio juosta = 10 µm.Vieno vaizdo mastelio juosta rodo visų vaizdų viename skydelyje mastelį.Neapdoroti duomenys pateikiami neapdorotų duomenų failų forma.
Remdamiesi αS / pLK elektrostatinio komplekso kondensacijos stebėjimais ir ankstesniais αS, kaip tau / RNR kondensato kliento molekulės stebėjimais per tiesioginę sąveiką su tau31, iškėlėme hipotezę, kad αS ir tau gali atsiskirti su tirpikliu, jei nėra RNR. kondensacija.per elektrostatinius kompleksus, o αS yra pastolių baltymas αS / Tau koacervatuose (žr. tau krūvio pasiskirstymą 2e paveiksle).Pastebėjome, kad LLPS buferyje sumaišius 10 μM αS ir 10 μM Tau441 (kurių sudėtyje yra atitinkamai 1 μM AF488-αS ir 1 μM Atto647N-Tau), jie lengvai susidarė baltymų agregatus, turinčius abu baltymus, kaip matyti iš WF mikroskopijos.(2a pav.).Dviejų baltymų kolokalizacija lašeliuose buvo patvirtinta konfokaline (CF) mikroskopija (papildomas 1a pav.).Panašus elgesys buvo pastebėtas, kai dekstranas-70 buvo naudojamas kaip agregacijos agentas (papildomas 1c pav.).Naudodami FITC pažymėtą PEG arba dekstraną, mes nustatėme, kad abu suspaudimo agentai buvo tolygiai paskirstyti mėginiuose, neparodydami nei segregacijos, nei asociacijos (papildomas 1d pav.).Atvirkščiai, tai rodo, kad šioje sistemoje jie skatina fazių atskyrimą per makromolekulinį išstūmimo efektą, nes PEG yra pirmiausia stabilus išstūmimo agentas, kaip matyti kitose LLP sistemose 33, 34.Šie baltymų turintys lašeliai buvo jautrūs NaCl (1 M), bet ne 1,6-HD (10 % v/v), patvirtindami jų elektrostatines savybes (papildomas 2a, b pav.).Jų skysčių elgesys buvo patvirtintas stebint milisekundžių susiliejančius lašelių įvykius naudojant BF mikroskopiją (2b pav.).
Konfokaliniai (CF) mikroskopiniai αS/Tau441 koacervavimo vaizdai LLPS buferyje (10 μM kiekvieno baltymo, 0,5 μM AF488 pažymėto αS ir Atto647N pažymėto Tau441).b Reprezentatyvūs αS/Tau441 lašelių susiliejimo įvykių diferencialinio interferencinio kontrasto (DIC) vaizdai (10 μM kiekvienam baltymui).c Fazių diagrama, pagrįsta Tau441 LLPS (0–15 µM) šviesos sklaida (esant 350 nm), kai nėra (kairėje) arba yra (dešinėje) 50 µM αS.Šiltesnės spalvos rodo didesnį išsibarstymą.d αS/Tau441 LLPS mėginių šviesos sklaida didėjant αS koncentracijai (Tau441 esant 5 µM, N = 2–3 mėginių pakartojimai, kaip nurodyta).e Scheminis kai kurių tau baltymo variantų ir skirtingų šiame tyrime naudojamų baltymo regionų vaizdavimas: neigiamo krūvio N-galo domenas (raudonas), prolino turtingas regionas (mėlynas), mikrotubulius surišantis domenas (MTBD, paryškintas oranžine spalva) ir amiloidą formuojanti porinė spiralė.gijų regionai (PHF), esantys MTBD (pilka).Rodomas Tau441 grynojo mokesčio už likutį (NCPR) žemėlapis.f Naudojant 1 µM AF488 pažymėtą αS ir Atto647N pažymėtą ΔNt-, naudojant 1 µM AF488 pažymėtą αS arba ΔCt-αS, esant ΔNt-Tau (viršuje, 10 µM vienam baltymui, K15 µM (baltyme) ) ) ) WF, kondensuoto LLPS arba K18 buferyje, mikrografijos.Viename paveikslėlyje esančios mastelio juostos rodo visų vaizdų mastelį viename skydelyje (20 µm plokštėms a, b ir f).Neapdoroti skydelių c ir d duomenys pateikiami kaip neapdorotų duomenų failai.
Norėdami patikrinti αS vaidmenį šiame LLPS procese, pirmiausia ištyrėme αS poveikį lašelių stabilumui nefelometrijos būdu, naudojant didėjančias NaCl koncentracijas (2c pav.).Kuo didesnė druskos koncentracija mėginiuose, kuriuose yra αS, tuo didesnės šviesos sklaidos reikšmės (esant 350 nm), o tai rodo stabilizuojantį αS vaidmenį šioje LLPS sistemoje.Panašų poveikį galima pastebėti padidinus αS koncentraciją (taigi ir αS:Tau441 santykį) iki maždaug.10 kartų padidėjimas lyginant su tau koncentracija (5 µM) (2d pav.).Norėdami parodyti, kad αS yra karkasinis baltymas koacervatuose, nusprendėme ištirti LLPS sutrikdyto Tau mutanto, kuriam trūksta neigiamai įkrautos N-galinės srities (1–150 likučių, žr. 2e pav.), vadinamo ΔNt-Tau, elgesį.WF mikroskopija ir nefelometrija patvirtino, kad pačiam ΔNt-Tau nebuvo atliktas LLPS (2f pav. ir papildomas 2d pav.), kaip buvo pranešta anksčiau 14. Tačiau kai į šio sutrumpinto Tau varianto dispersinius tirpalus buvo pridėta αS, LLPS procesas buvo visiškai atliktas. atkurtas, kai lašelių tankis yra artimas viso dydžio Tau ir αS tirpalų lašelių tankiui esant panašioms sąlygoms ir baltymų koncentracijai.Šis procesas taip pat gali būti stebimas esant mažam makromolekuliniam susitraukimui (papildomas 2c pav.).C-galo αS srities, bet ne viso jos ilgio, vaidmuo LLPS procese buvo įrodytas lašelių susidarymo slopinimu, naudojant C-galo sutrumpintą αS variantą, kuriame nėra 104–140 liekanų (1a pav.) (ΔCt- αS) baltymo (2f pav. ir papildomas 2d pav.).αS ir ΔNt-Tau kolokalizacija buvo patvirtinta konfokaline fluorescencine mikroskopija (papildomas 1b pav.).
Norint toliau išbandyti LLPS mechanizmą tarp Tau441 ir αS, buvo naudojamas papildomas Tau variantas, būtent suporuotas spiralinės gijos šerdies (PHF) fragmentas mikrotubulų surišimo domene (MTBD), kuris, jei jame yra keturi būdingi pasikartojantys domenai, paprastai taip pat žinomi. kaip K18 fragmentas (žr. 2e pav.).Neseniai buvo pranešta, kad αS pirmiausia jungiasi su tau baltymu, esančiu prolino turtingame domene, seka, kuri yra prieš mikrotubulus surišantį domeną.Tačiau PHF regione taip pat gausu teigiamai įkrautų likučių (žr. 2e paveikslą), ypač lizino (15% likučių), o tai paskatino mus patikrinti, ar šis regionas taip pat prisideda prie αS / Tau komplekso kondensacijos.Pastebėjome, kad vien tik K18 negalėjo sukelti LLPS, kai koncentracija yra iki 100 μM tirtomis sąlygomis (LLPS buferis su 15% PEG arba 20% dekstrano) (2f pav.).Tačiau pridėjus 50 µM αS prie 50 µM K18, greitas baltymų lašelių, turinčių K18 ir αS, susidarymas buvo pastebėtas atliekant nefelometriją (papildomas 2d pav.) ir WF mikroskopiją (2f pav.).Kaip ir tikėtasi, ΔCt-αS negalėjo atkurti K18 LLPS elgesio (2f pav.).Atkreipiame dėmesį, kad αS / K18 agregacijai reikia šiek tiek didesnės baltymų koncentracijos, kad sukeltų LLPS, palyginti su αS / ΔNt-Tau arba αS / Tau441, o kiti dalykai yra vienodi.Tai atitinka stipresnę αS C-galinio regiono sąveiką su prolino turtingu Tau domenu, palyginti su mikrotubulius surišančiu domenu, kaip aprašyta anksčiau 31 .
Atsižvelgiant į tai, kad ΔNt-Tau negali atlikti LLPS, jei nėra αS, pasirinkome šį Tau variantą kaip αS / Tau LLPS apibūdinimo modelį, atsižvelgiant į jo paprastumą LLPS sistemose su viso ilgio Tau (izotipas, Tau441 / Tau441).su kompleksiniais (heterotipiniais, αS/Tau441) agregacijos procesais.Palyginome αS agregacijos laipsnį (kaip kondensuotos fazės baltymo fαS,c dalį) αS/Tau ir αS/ΔNt-Tau sistemose centrifuguodami ir dispersinės fazės SDS-PAGE analize (žr. 2e), radome labai panašias vertes. visiems tos pačios koncentracijos baltymams.Visų pirma, mes gavome fαS,c 84 ± 2% ir 79 ± 7% atitinkamai αS / Tau ir αS / ΔNt-Tau, o tai rodo, kad heterotipinė sąveika tarp αS ir tau yra pranašesnė už sąveiką tarp tau molekulių.tarp.
Sąveika su įvairiais polikatijonais ir kondensacijos proceso įtaka αS kinetikai pirmiausia buvo tiriama fluorescencijos atkūrimo po fotobalinimo (FRAP) metodu.Išbandėme αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ir αS/pLK koacervatus (100 μM αS, papildytą 2 μM αS AF488-αS ir 100 μM Tau441 arba ΔNt-MLK p arba ).Duomenys buvo gauti per pirmąsias 30 minučių po mėginio komponentų sumaišymo.Iš reprezentatyvių FRAP vaizdų (3a pav., αS/Tau441 kondensacija) ir juos atitinkančių laiko eigos kreivių (3b pav., papildomas 3 pav.) matyti, kad αS kinetika yra labai panaši į Tau441 koacervatų.ir ΔNt-Tau, kuris yra daug greitesnis naudojant pLK.Apskaičiuoti αS difuzijos koeficientai koacervato viduje pagal FRAP (kaip aprašyta Kang ir kt. 35) yra D = 0,013 ± 0,009 µm2/s ir D = 0,026 ± 0,008 µm2/s, kai αS/Tau441 ir N t αS/ sistema.pLK, Tau ir D = atitinkamai 0,18 ± 0,04 µm2/s (3c pav.).Tačiau difuzijos koeficientas αS dispersinėje fazėje yra keliomis eilėmis didesnis už visas kondensuotas fazes, kaip nustatyta fluorescencinės koreliacijos spektroskopija (FCS, žr. papildomą 3 pav.) tomis pačiomis sąlygomis (LLPS buferis), bet nesant polikatijonų. (D = 8 ± 4 µm2/s).Todėl αS transliacijos kinetika koacervatuose, palyginti su dispersinės fazės baltymais, žymiai sumažėja dėl ryškaus molekulinio išstūmimo efekto, nors visi koacervatai, priešingai nei tau fazėje, per pirmąjį pusvalandį po jų susidarymo išlaiko į skystį panašias savybes.greitesnė kinetika pLK kondensate.
a–c FRAP analizė αS dinamikos (2 % AF488 pažymėtos αS) elektrostatiniuose koacervatuose.Reprezentatyvūs αS / Tau441 FRAP tyrimų vaizdai trimis egzemplioriais parodyti a punkte, kur raudoni apskritimai rodo nuspalvintas sritis.Mastelio juosta yra 5 µm.b Vidutinės FRAP kreivės ir (c) apskaičiuoti difuzijos koeficientai (D) 5–6 (N) skirtingiems lašeliams iš trijų eksperimentų, naudojant 100 µM αS ir ekvimolinę Tau441 (raudona) arba ΔNt-Tau (mėlyna) arba pLK (žalia) koncentracijas. dešimt kartų didesne nei LLPS koncentracija.Standartinis FRAP kreivės nuokrypis rodomas tamsinta spalva.Palyginimui, difuzijos koeficientas αS dispersinėje fazėje buvo nustatytas trimis egzemplioriais, naudojant fluorescencinės koreliacijos spektroskopiją (FCS) (daugiau informacijos žr. 3 papildomą paveikslą ir metodus).d Nuolatiniai X juostos EPR spektrai 100 μM TEMPOL-122-αS LLPS buferyje be polikatiacijos (juoda) arba esant 100 μM Tau441 (raudona) arba ΔNt-Tau (mėlyna) arba 1 mM pLK (žalia).Įdėklas rodo padidintą stiprių lauko linijų vaizdą, kur vyksta didžiausi pokyčiai.e 50 μM TEMPOL-122-αS surišimo kreivės su įvairiais polikatijonais, kai nėra LLPS (be PEG).Nustatyta, kad sumažinta III juostos amplitudė, palyginti su normalizuoto EPR spektro II juosta (IIII/III), padidina Tau441 (raudona), ΔNt-Tau (mėlyna) ir pLK (žalia) molinius santykius.Spalvotos linijos rodo atitikimą duomenims naudojant grubų surišimo modelį su n identiškų ir nepriklausomų surišimo vietų kiekvienoje kreivėje.Neapdoroti duomenys pateikiami neapdorotų duomenų failų forma.
Kaip papildymą, mes ištyrėme αS dinamiką įvairiuose koacervatuose, naudodami nukreiptą sukimosi žymėjimą (SDSL) ir nuolatinį elektronų paramagnetinį rezonansą (CW-EPR).Šis metodas pasirodė esąs labai naudingas pranešant apie IDP lankstumą ir dinamiką su realia likutine skiriamąja geba 36, ​​37, 38.Šiuo tikslu mes sukūrėme cisteino liekanas pavieniuose Cys mutantuose ir panaudojome 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksilo (TEMPOL) sukimosi zondą.Maleimido dariniai juos žymi.Tiksliau, mes įdėjome TEMPOL zondus 122 arba 24 αS padėtyje (TEMPOL-122-αS ir TEMPOL-24-αS).Pirmuoju atveju mes nukreipiame į baltymo C-galinę sritį, kuri yra susijusi su sąveika su polikatijonais.Vietoj to, 24 padėtis gali suteikti mums informacijos apie bendrą kondensato baltymų dinamiką.Abiem atvejais EPR signalai, gauti dispersinės fazės baltymams, atitiko nitroksido radikalus greitai judančioje būsenoje.Po fazių atskyrimo, esant tau arba pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 arba ΔNt-Tau santykiu 1:1 arba pLK santykiu 1:10), santykinio smailės intensyvumo padidėjimas buvo pastebėtas αS EPR spektras.Praradimo linija išsiplėtė, o tai rodo, kad lašeliuose sumažėja αS perorientavimo kinetika, palyginti su baltymu praskiestoje fazėje (3d pav., papildomas 4a pav.).Šie pokyčiai yra ryškesni 122 padėtyje. Nors 24 padėtyje pLK buvimas neturėjo įtakos zondo kinetikai, 122 padėtyje spektrinės linijos forma labai pasikeitė (papildomas 4a pav.).Kai bandėme modeliuoti dviejų αS / polikationų sistemų 122 padėtyje esančius spektrus, naudodami izotropinį modelį (papildomas 5a paveikslas), dažniausiai naudojamą sukimo ženklu pažymėto IDP38, 39 dinamikai apibūdinti, negalėjome rekonstruoti eksperimentinių spektrų..24 sukimosi kontrastų padėties spektrinis modeliavimas (papildomas 5a pav.).Tai rodo, kad esant polikatijonams, αS C-galinės srities sukimosi konfigūracijų erdvėje yra pirmenybės.Atsižvelgiant į αS frakciją kondensuotoje fazėje eksperimentinėmis EPR sąlygomis (84 ± 2%, 79 ± 7% ir 47 ± 4% atitinkamai αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau ir αS / pLK), žr. Duomenų analizės c pav. 2e, matyti, kad EPR metodu aptiktas išsiplėtimas daugiausia atspindi αS C-galinės srities sąveiką su įvairiais polikatijonais kondensuotoje fazėje (pagrindinis pokytis naudojant TEMPOL-122- αS), o ne baltymų kondensacija.Zonde stebimas mikroklampumo padidėjimas.Kaip ir tikėtasi, baltymo EPR spektras kitomis sąlygomis nei LLPS buvo visiškai atkurtas, kai į mišinį buvo pridėta 1 M NaCl (papildomas 4b pav.).Apskritai, mūsų duomenys rodo, kad CW-EPR aptikti pokyčiai daugiausia atspindi αS C-galinės srities sąveiką su įvairiais polikatijonais kondensuotoje fazėje, ir ši sąveika atrodo stipresnė su pLK nei su Tau.
Siekdami gauti daugiau struktūrinės informacijos apie koacervato baltymus, nusprendėme ištirti LLPS sistemą, naudodami BMR tirpale.Tačiau mes galėjome aptikti tik išsklaidytoje fazėje likusią αS frakciją, kuri gali būti dėl sumažėjusios baltymų dinamikos koacervato viduje ir tankios fazės tirpalo apačioje atliekant BMR analizę.Kai išanalizavome baltymo, likusio LLPS mėginio išsklaidytoje fazėje, struktūrą ir dinamiką naudojant BMR (papildomas 5c, d pav.), pastebėjome, kad baltymas elgėsi beveik identiškai esant pLK ir ΔNt-Tau. kurie buvo antrinėje baltymų stuburo struktūroje ir dinamikoje, atskleidė antrinio cheminio poslinkio ir R1ρ atsipalaidavimo eksperimentai.BMR duomenys rodo, kad αS C-galas smarkiai praranda konformacinį lankstumą, išlaikant savo netvarkingą pobūdį, kaip ir likusią baltymų seką, dėl sąveikos su polikatijonais.
Kadangi CW-EPR signalo išplėtimas, pastebėtas kondensuotoje TEMPOL-122-αS fazėje, atspindi baltymo sąveiką su polikatijonais, atlikome EPR titravimą, kad įvertintume αS prisijungimo afinitetą su įvairiais polikatijonais, kai nėra LLPS (nėra Buferis LLPS), o tai rodo, kad praskiestų ir koncentruotų fazių sąveika yra vienoda (ką patvirtina mūsų duomenys, papildomas 4a pav. ir 6 papildomas pav.).Tikslas buvo išsiaiškinti, ar visi koacervatai, nepaisant jų bendrų į skystį panašių savybių, turi skirtingą elgesį molekuliniu lygmeniu.Kaip ir tikėtasi, EPR spektras išsiplėtė didėjant polikatijonų koncentracijai, atspindėdamas molekulinio lankstumo sumažėjimą dėl visų sąveikos partnerių molekulinės sąveikos beveik iki prisotinimo (3e pav., 6 papildomas pav.).pLK pasiekė šį prisotinimą esant mažesniam moliniam santykiui (polikatijonas: αS), palyginti su ΔNt-Tau ir Tau441.Tiesą sakant, palyginus duomenis su apytiksliu surišimo modeliu, darant prielaidą, kad yra n identiškų ir nepriklausomų surišimo vietų, paaiškėjo, kad tariama pLK disociacijos konstanta (~ 5 μM) yra eilės tvarka mažesnė nei Tau441 arba ΔNt-Tau (~ 50 μM). ).µM).Nors tai yra apytikslis įvertinimas, tai rodo, kad αS turi didesnį afinitetą paprastesniems polikatijonams su nuolatinio teigiamo krūvio sritimis.Atsižvelgdami į šį afiniteto skirtumą tarp αS ir įvairių polikatijonų, iškėlėme hipotezę, kad jų skysčio savybės laikui bėgant gali skirtis ir todėl nukentėti nuo skirtingų LSPT procesų.
Atsižvelgiant į labai perpildytą baltymų koacervato aplinką ir baltymo amiloidinį pobūdį, laikui bėgant stebėjome koacervato elgesį, kad nustatytų galimus LSPT procesus.Naudodami BF ir CF mikroskopiją (4 pav.), pastebėjome, kad αS / Tau441 didžiąja dalimi koacervuoja tirpale, sudarydamas didelius lašelius, kurie liečiasi ir sudrėkina paviršių šulinio / stiklelio apačioje kaip pilni lašeliai, kaip tikėtasi (papildomas pav. 7d);šias iš apačios suformuotas struktūras vadiname „baltymų plaustais“.Šios struktūros išliko skystos, nes išlaikė gebėjimą susilieti (papildomas 7b pav.) ir buvo matomos keletą valandų po to, kai suveikė LLPS (4 pav. ir papildomas 7c pav.).Pastebėjome, kad drėkinimo procesas yra palankesnis hidrofilinių, o ne hidrofobinių medžiagų paviršiuje (papildomas 7a pav.), kaip tikimasi elektrostatiniams koacervatams su nesubalansuotais krūviais ir dėl to dideliu elektrostatiniu paviršiaus potencialu.Pažymėtina, kad αS/ΔNt-Tau koalescencija ir plaukimas plaustais buvo žymiai sumažintas, o αS/pLK kondensatų kiekis buvo žymiai sumažintas (4 pav.).Per trumpą inkubacijos laiką αS / pLK lašeliai sugebėjo susijungti ir sudrėkinti hidrofilinį paviršių, tačiau šis procesas greitai sustojo ir po 5 valandų inkubacijos buvo pastebėti tik riboti susiliejimo įvykiai ir jokio drėkinimo.– gelio-lašinimo perėjimas.
Tipiški BF (pilkos atspalvių plokštės) ir CF (dešinės plokštės, AF488 pažymėtas αS žaliai) koacervato mėginiams, kuriuose yra 100 µM αS (1 % fluorescencinė etiketė) LLPS buferyje, esant 100 µM Tau441 (viršuje) mikrofluorescenciniams vaizdams. -Tau (centre) arba 1 mM pLK (apačioje) skirtingu inkubacijos laiku ir židinio aukščiais (z, atstumas nuo plokštelės šulinio apačios).Eksperimentai buvo kartojami 4-6 kartus, nepriklausomai vienas nuo kito, o rezultatai buvo tokie patys.αS/Tau441 koacervatai sušlapinami po 24 valandų, todėl susidaro didesni nei paveikslėlyje plaustai.Visų vaizdų mastelio juosta yra 20 µm.
Tada paklausėme, ar dideli į skysčius panašūs baltymų telkiniai, susidarę αS / Tau441 LLPS, sukels bet kurio iš tirtų baltymų amiloidinę agregaciją.Stebėjome αS/Tau441 lašelių brendimą laikui bėgant WF mikroskopu tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir aukščiau, bet naudojant 1 μM AF488 pažymėtą αS ir Atto647N pažymėtą Tau441 (5a pav.).Kaip ir tikėtasi, per visą brendimo procesą stebėjome visišką baltymų lokalizaciją.Įdomu tai, kad nuo maždaug.Po 5 valandų plaustų viduje buvo pastebėtos intensyvesnės neapskritimo formos struktūros, kurias pavadinome „taškais“, kai kurie iš jų buvo kolokalizuoti αS, o kai kurie buvo praturtinti Tau441 (5a pav., baltos rodyklės).Šios dėmės plaustuose visada buvo labiau stebimos αS / ΔNt-Tau nei αS / ΔNt-Tau.PLK ir Tau sistemų, nekompetentingų susiliejimui / drėkinimui, lašeliuose nebuvo atskirų dėmių.Norėdami patikrinti, ar šios dėmės, kuriose yra αS ir Tau441, yra į amiloidą panašūs agregatai, atlikome panašų eksperimentą, naudodami CF mikroskopiją, kuriame Tau441 buvo pažymėtas Atto647N ir nuo pat pradžių buvo pridėta 12, 5 μM amiloidui būdingo tioflavino-T (ThT).dažai.Nors αS/Tau441 lašelių ar plaustų ThT dažymas nebuvo pastebėtas net po 24 valandų inkubacijos (5b pav., Viršutinė eilutė – likę lašeliai virš baltymų plaustų), ThT teigiamos struktūros, kuriose yra Atto647N-Tau441 plaustų viduje, buvo labai silpnos.tai atkartoja anksčiau aprašytų dėmių dydį, formą ir vietą (5b pav., vidurinė ir apatinė eilutės), o tai rodo, kad dėmės gali atitikti amiloidą primenančius agregatus, susidariusius senstančiose skysčių koacervatuose.
WF 25 μM αS įvairiais inkubacijos laikais ir židinio aukščiais (z, atstumas nuo nesurišto dugno), kai yra 25 μM Tau441 (1 μM AF488 pažymėtas αS ir Atto647N pažymėtas Tau441) mikroskopo buferio plokštelės šulinyje su LLPS .Šeši eksperimentai buvo nepriklausomai pakartoti su panašiais rezultatais.b CF mikroskopinis 25 μM αS vaizdas, kai yra 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N pažymėtas Tau441) ir 12,5 μM tioflavinas-T (ThT).Svertiniai baltymų lašeliai ir nusėdę baltymų plaustai bei dėmės rodomi atitinkamai viršutinėje ir vidurinėje eilutėse.Apatinėje eilutėje rodomi plaustų ir kritimų vaizdai iš 3 nepriklausomų kopijų.Baltos rodyklės rodo ThT teigiamus taškus abiejose plokštėse.Visų vaizdų mastelio juosta yra 20 µm.
Norėdami išsamiau išnagrinėti koacervato baltymų tinklo pokyčius pereinant iš skysto į kietą, naudojome fluorescencinį viso gyvenimo vaizdavimą (FLIM) ir Försterio rezonanso energijos perdavimo mikroskopiją (FRET) (6 paveikslas ir papildomi 8 ir 9 paveikslai).Iškėlėme hipotezę, kad sluoksnio koacervatinis brendimas į labiau kondensuotą ar net kietą agreguotą baltymo struktūrą lemia glaudesnį baltymo ir prie jo prijungto fluorescencinio zondo kontaktą, o tai gali sukelti gesinimo efektą, pasireiškiantį sutrumpėjusiu zondo tarnavimo laiku (τ). , kaip aprašyta anksčiau40.,41,42.Be to, dvigubai pažymėtų mėginių (AF488 ir Atto647N, atitinkamai kaip FRET donorų ir akceptorių dažų) atveju šį τ sumažėjimą taip pat gali lydėti koacervato kondensacija ir FRET (E) efektyvumo padidėjimas LSPT metu.Stebėjome plaustų ir dėmių susidarymą laikui bėgant LLPS αS/Tau441 ir αS/ΔNt-Tau mėginiuose (25 µM kiekvieno baltymo LLPS buferyje, kuriame yra 1 µM AF488 pažymėto αS ir (arba) Atto647N, pažymėto Tau441 arba ΔNt-Tau).Pastebėjome bendrą tendenciją, kad AF488 (τ488) ir Atto647N (τ647N) zondų fluorescencijos trukmė šiek tiek sumažėjo, nes subrendo koacervatai (6 pav. ir papildomas 8c pav.).Įdomu tai, kad šis pokytis buvo žymiai sustiprintas taškams plaustuose (6c pav.), o tai rodo, kad taškuose įvyko tolesnis baltymų kondensatas.Tai patvirtina, kad αS / ΔNt-Tau lašeliams, sendintam 24 valandas (papildomas 8d pav.), reikšmingų fluorescencijos trukmės pokyčių nepastebėta, o tai rodo, kad lašelių geliacija yra procesas, kuris skiriasi nuo dėmių atsiradimo ir jo nelydi reikšmingas molekulinis pertvarkymas. koacervatuose.Reikėtų pažymėti, kad αS taškai yra skirtingo dydžio ir kintamo turinio, ypač αS / Tau441 sistemoje (papildomas 8e pav.).Taškinės fluorescencijos trukmės sumažėjimą lydėjo intensyvumo padidėjimas, ypač Atto647N, pažymėtos Tau441 (papildomas 8a pav.), ir didesnis FRET efektyvumas tiek αS / Tau441, tiek αS / ΔNt-Tau sistemoms, o tai rodo tolesnį kondensavimąsi per penkias valandas LLPS. po suveikimo statinės elektros viduje esantys baltymai kondensavosi.Palyginti su αS / ΔNt-Tau, αS / Tau441 dėmėse stebėjome mažesnes τ647N ir šiek tiek didesnes τ488 reikšmes, kartu su mažesnėmis ir nehomogeniškesnėmis FRET reikšmėmis.Galbūt tai gali būti susiję su tuo, kad αS / Tau441 sistemoje stebimas ir numatomas αS gausumas agregatuose yra nevienalytesnis, dažnai substechiometrinis, palyginti su Tau, nes pačiam Tau441 taip pat gali pasireikšti LLPS ir agregacija (papildomas 8e pav.) .Tačiau lašelių susiliejimo laipsnis, plaustų susidarymas ir, svarbiausia, baltymų agregacija į skystį panašiuose koacervatuose yra didžiausias, kai yra ir Tau441, ir αS.
αS/Tau441 ir αS/ΔNt-Tau fluorescencinės mikroskopijos (FLIM) vaizdai esant 25 μM kiekvieno baltymo (1 μM AF488 pažymėto αS ir 1 μM Atto647N pažymėto Tau441 arba ΔNt buferio).Stulpeliuose rodomi reprezentatyvūs LLPS mėginių vaizdai skirtingu brandinimo laiku (30 min., 5 val. ir 24 val.).Raudoname rėmelyje rodoma sritis, kurioje yra αS / Tau441 dėmės.Gyvenimo trukmė rodoma kaip spalvų juostos.Mastelio juosta = 20 µm visiems vaizdams.b Padidintas pasirinktos srities FLIM vaizdas, rodomas raudoname langelyje skydelyje a.Gyvenimo intervalai rodomi naudojant tą pačią spalvų skalę, kaip ir skydelyje a.Mastelio juosta = 5 µm.c Histogramos, rodančios AF488 (prijungtas prie αS) arba Atto647N (pritvirtintas prie Tau) skirtingoms baltymų rūšims (lašeliai-D-, plaustas-R- ir dėmės-P), nustatytos FLIM vaizduose, įrašytuose αS-), laiko pasiskirstymo Tau441 ir Tau441 gyvavimo trukmė. αS/ΔNt-Tau koacervuoti mėginiai (N = 17-32 ROI D, 29-44 ROI R ir 21-51 ROI taškams).Vidutinės ir vidutinės vertės rodomos atitinkamai kaip geltoni kvadratai ir juodos linijos langelių viduje.Apatinė ir viršutinė langelio ribos žymi atitinkamai pirmąjį ir trečiąjį kvartilius, o minimalios ir didžiausios vertės 1,5 karto tarpkvartilių diapazone (IQR) rodomos kaip ūsai.Nukrypimai rodomi kaip juodi deimantai.Statistinis reikšmingumas tarp pasiskirstymo porų buvo nustatytas naudojant dviejų imčių t testą, darant prielaidą, kad dispersijos yra nevienodos.Dviejų krypčių t-testo p vertės rodomos žvaigždutėmis kiekvienai palygintų duomenų porai (* p reikšmė > 0,01, ** p reikšmė > 0,001, *** p reikšmė > 0,0001, **** p reikšmė > 0,00001), ns Nurodo nereikšmingumą (p vertė > 0,05).Tikslios p reikšmės pateiktos 1 papildomoje lentelėje, o pirminiai duomenys pateikiami kaip neapdorotų duomenų failai.
Norėdami dar labiau parodyti į amiloidą panašų dėmių / agregatų pobūdį, nedažytus koacervato mėginius 24 valandas apdorojome didelėmis (1 M) NaCl koncentracijomis, todėl agregatai buvo atskirti nuo baltymų koacervatų.Kai izoliuoti agregatai (ty išsklaidytas agregatų tirpalas) buvo stebimi naudojant atominės jėgos mikroskopiją (AFM), pastebėjome daugiausia sferinę morfologiją, kurios reguliarus aukštis yra apie 15 nm, kuri linkusi asocijuotis didelės druskos koncentracijos sąlygomis, panašiai kaip tipiškų amiloidinių fibrilių elgesys dėl stipraus hidrofobinio poveikio paviršiui (atkreipkite dėmesį, kad fibrilių aukštis paprastai yra ~ 10 nm) (papildomas 10a pav.).Įdomu tai, kad kai izoliuoti agregatai buvo inkubuojami su ThT standartiniame ThT fluorescencijos tyrime, pastebėjome dramatišką ThT fluorescencijos kvantinės išeigos padidėjimą, panašų į tą, kuris buvo pastebėtas, kai dažai buvo inkubuojami su tipiškomis αS amiloidinėmis fibrilėmis (papildomas 10b pav.), o tai rodo, kad. koacervato agregatuose yra į amiloidą panašių struktūrų..Tiesą sakant, agregatai buvo tolerantiški didelei druskos koncentracijai, bet jautrūs 4 M guanidino chloridui (GdnHCl), kaip ir tipiškos amiloidinės fibrilės (papildomas 10c pav.).
Toliau išanalizavome agregatų sudėtį naudodami vienos molekulės fluorescenciją, specifinę fluorescencinės koreliacijos / kryžminės koreliacijos spektroskopiją (FCS / FCCS) ir dviejų spalvų sutapimo aptikimo (TCCD) analizę.Šiuo tikslu išskyrėme agregatus, susidariusius po 24 valandų inkubavimo 100 μl LLPS mėginiuose, kuriuose yra αS ir Tau441 (abu 25 μM), kartu su 1 μM AF488 pažymėtu αS ir 1 μM Atto647N pažymėtu Tau441N.Gautą dispersinį agregato tirpalą praskieskite iki monomolekulinės būsenos, naudodami tą patį buferį be PEG ir 1 M NaCl (tas pats buferis naudojamas agregatams atskirti nuo koacervato), kad išvengtumėte galimos elektrostatinės sąveikos tarp LLPS ir baltymo.Vienos molekulės laiko trajektorijos pavyzdys matomas 7a pav.FCCS/FCS analizė (kryžminė koreliacija, CC ir autokoreliacija, AC) parodė, kad agregatų, turinčių αS ir tau, mėginiuose buvo gausu (žr. CC kreivę 7b pav., kairiajame skydelyje), o likutinio monomerinio baltymo perteklius atsirado kaip praskiedimo proceso rezultatas (žr. AC kreives 7b paveiksle, kairiajame skydelyje).Kontroliniai eksperimentai, atlikti tomis pačiomis tirpalo sąlygomis, naudojant mėginius, kuriuose yra tik monomerinių baltymų, neparodė CC kreivių, o AC kreivės gerai dera su vieno komponento difuzijos modeliu (4 lygtis), kur monomeriniai baltymai turi numatomus difuzijos koeficientus (7b pav. ), dešinysis skydelis).Agreguotų dalelių difuzijos koeficientas yra mažesnis nei 1 µm2/s, o monomerinių baltymų – apie 1 µm2/s.50–100 µm/s;vertės yra panašios į anksčiau paskelbtas ultragarsu apdorotų αS amiloidinių fibrilių ir monomerinių αS reikšmes atskirai panašiomis tirpalo sąlygomis44.Kai išanalizavome agregatus su TCCD sprogimo analize (7c pav., viršutinis skydelis), nustatėme, kad kiekviename izoliuotame agregate (αS/Tau heteroagregate) apie 60 % aptiktų agregatų buvo ir αS, ir tau, apie 30 % buvo tik tau, tik apie 10 % αS.Stechiometrinė αS / Tau heteroagregatų analizė parodė, kad dauguma heteroagregatų buvo praturtinti tau (stechiometrija mažesnė nei 0,5, vidutinis tau molekulių skaičius viename agregate yra 4 kartus didesnis nei αS molekulių), o tai atitinka mūsų darbą, stebimą FLIM in situ. eksperimentai..FRET analizė parodė, kad šiuose agregatuose buvo abu baltymai, nors tikrosios FRET reikšmės šiuo atveju nėra labai svarbios, nes fluoroforų pasiskirstymas kiekviename agregate buvo atsitiktinis dėl eksperimente naudoto nepažymėto baltymo pertekliaus.Įdomu tai, kad kai atlikome tą pačią analizę naudodami 45,46 subrendusio amiloido agregacijos deficito Tau variantą (žr. papildomą 11a, b pav.), pastebėjome, kad nors αS elektrostatinė agregacija buvo tokia pati (papildomas 11c, d pav.), gebėjimas formuoti agregatus koacervate buvo smarkiai sumažintas, o FLIM aptiko keletą dėmių in situ eksperimentuose, o izoliuotų jungtinių mėginių kryžminės koreliacijos kreivės buvo pastebėtos silpnos.Tačiau nedideliam skaičiui aptiktų agregatų (tik dešimtoji Tau441) pastebėjome, kad kiekvienas agregatas buvo praturtintas αS nei šis Tau variantas, o maždaug 50% aptiktų agregatų turi tik αS molekules, o αS buvo nevienalytė perteklius. .agregatai (žr. papildomą 11e pav.), priešingai nei Tau441 generuojami nevienalyčiai agregatai (6f pav.).Šių eksperimentų rezultatai parodė, kad nors pats αS gali kauptis su tau koacervate, tau branduolių susidarymas tokiomis sąlygomis yra palankesnis, o susidarę į amiloidą panašūs agregatai gali veikti kaip αS ir tau forma.Tačiau, kai susiformuoja tau turtinga šerdis, heterotipinė sąveika tarp αS ir tau yra teikiama pirmenybė agregatams, o ne homotipinė sąveika tarp tau molekulių;taip pat stebime baltymų tinklus skystuose αS / tau koacervatuose.
aS/Tau441 elektrostatiniuose koacervatuose susidariusių atskirų izoliuotų agregatų molekulių reprezentatyvūs fluorescenciniai laiko pėdsakai.Trijuose aptikimo kanaluose (AF488 ir Atto647N emisija po tiesioginio sužadinimo, mėlynos ir raudonos linijos, Atto647N emisija po netiesioginio sužadinimo), FRET, violetinė linija buvo stebimi sprogimai, atitinkantys αS / Tau441 koagregatus (sprogimai viršijant nurodytą slenkstį).b Išskirtų αS/Tau441 agregatų mėginio, gauto iš LLPS, FCS/FCCS analizė (kairysis skydelis).AF488 ir Atto647N autokoreliacijos (AC) kreivės rodomos atitinkamai mėlyna ir raudona spalva, o kryžminės koreliacijos (CC) kreivės, susietos su agregatais, kuriuose yra abiejų dažiklių, rodomos purpurine spalva.AC kreivės atspindi pažymėtų monomerinių ir agreguotų baltymų rūšių buvimą, o CC kreivės rodo tik dvigubai pažymėtų agregatų difuziją.Ta pati analizė, bet tomis pačiomis tirpalo sąlygomis kaip ir izoliuotose dėmėse, mėginiai, kuriuose yra tik monomerinis αS ir Tau441, rodomi kaip kontroliniai elementai dešiniajame skydelyje.c αS/Tau441 elektrostatiniuose koacervatuose susidariusių izoliuotų agregatų atskirų molekulių fluorescencinė greitoji analizė.Informacija apie kiekvieną agregatą, rastą keturiuose skirtinguose pasikartojimuose (N = 152), pavaizduota pagal jų stechiometriją, S reikšmes ir FRET efektyvumą (viršutinis skydelis, spalvų juosta atspindi įvykį).Galima išskirti tris agregatų tipus: -αS-tik agregatai su S~1 ir FRET~0, Tau-tik agregatai su S~0 ir FRET~1 ir heterogeniniai Tau/αS agregatai su tarpiniu S ir FRET Kiekio įvertinimai abiejų žymenų baltymų, aptiktų kiekviename nevienalyčiame agregate (N = 100), rodomi apatiniame skydelyje (spalvų skalė atspindi įvykį).Neapdoroti duomenys pateikiami neapdorotų duomenų failų forma.
Buvo pranešta, kad skystų baltymų kondensatų brendimas arba senėjimas į gelio pavidalo arba kietas struktūras laikui bėgant yra susijęs su keliomis fiziologinėmis kondensato funkcijomis47, taip pat su ligomis, kaip nenormalus procesas prieš amiloido agregaciją 7, 48, 49. mes išsamiai tiriame fazių atskyrimą ir elgesį.LSPT αS esant atsitiktiniams polikatijonams kontroliuojamoje aplinkoje, esant mažoms mikromolinėms koncentracijoms ir fiziologiškai svarbiomis sąlygomis (atkreipkite dėmesį, kad apskaičiuota αS fiziologinė koncentracija yra > 1 µM50), atsižvelgiant į tipišką termodinaminį LPS elgesį.Mes nustatėme, kad αS, kuriame esant fiziologiniam pH yra labai neigiamai įkrauta C-galo sritis, gali sudaryti baltymų turinčius lašelius vandeniniame tirpale per LLPS, esant labai katijoniniams netvarkingiems peptidams, tokiems kaip pLK arba Tau, per elektrostatinį procesą. kompleksinė kondensacija esant agregacinėms makromolekulėms.Šis procesas gali turėti reikšmingą poveikį ląstelių aplinkai, kur αS susiduria su įvairiomis polikatijoninėmis molekulėmis, susijusiomis su jo liga susijusia agregacija tiek in vitro, tiek in vivo 51, 52, 53, 54.
Daugelyje tyrimų baltymų dinamika lašeliuose buvo laikoma vienu iš pagrindinių veiksnių, lemiančių brendimo procesą55, 56.Elektrostatiniuose αS koacervacijose su polikatijonais brendimo procesas, matyt, priklauso nuo sąveikos su polikatijonais stiprumo, valentingumo ir šių sąveikų įvairovės.Pusiausvyros teorija rodo, kad dviejų skystų būsenų pusiausvyros kraštovaizdis būtų didelis lašelis, kuriame gausu biopolimerų, skatinančių LLPS57, 58.Lašelių augimą galima pasiekti brendant Ostwald59, sujungiant60 arba naudojant laisvą monomerą dispersinėje fazėje61.αS ir Tau441, ΔNt-Tau arba pLK atveju didžioji dalis baltymų buvo koncentruota kondensate šio tyrimo sąlygomis.Tačiau, nors pilno dydžio tau lašeliai greitai susijungė sušlapus paviršiui, ΔNt-Tau ir pLK buvo sunku susijungti ir sudrėkinti lašelius, o tai rodo greitą skysčio savybių praradimą šiose dviejose sistemose.Remiantis mūsų FLIM-FRET analize, pasenę pLK ir ΔNt-Tau lašeliai parodė panašų baltymų agregacijos laipsnį (panašų fluorescencijos trukmę), kaip ir pirminiai lašeliai, o tai rodo, kad pradinis baltymų tinklas buvo išsaugotas, nors ir standesnis.
Savo eksperimentinius rezultatus racionalizuojame pagal šį modelį (8 pav.).Iš pradžių laikinai susidarę lašeliai dažnai yra baltymų tinklai be elektrostatinės kompensacijos, todėl atsiranda krūvio disbalanso sritys, ypač lašelių sąsajoje, todėl susidaro lašeliai, turintys didelį elektrostatinį paviršiaus potencialą.Norint kompensuoti krūvį (reiškinį, paprastai vadinamą valencijos išeikvojimu) ir sumažinti lašelių paviršiaus potencialą, lašeliai gali apimti naujus polipeptidus iš praskiestos fazės, pertvarkyti baltymų tinklus, kad optimizuotų krūvio ir krūvio sąveiką, ir sąveikauti su kitais lašeliais.su paviršiais (drėkinimas).Atrodo, kad αS/pLK lašeliai dėl savo paprastesnio baltymų tinklo (tik heterotipinės sąveikos tarp αS ir pLK) ir didesnio afiniteto baltymų ir baltymų sąveikai gali greičiau subalansuoti kondensato krūvį;iš tiesų, mes stebėjome greitesnę baltymų kinetiką iš pradžių suformuotuose αS / pLK koacervatuose nei αS / Tau.Išnykus valentui, sąveika tampa ne tokia trumpalaikė, o lašeliai praranda savo skystąsias savybes ir virsta gelio pavidalo, nedegiais lašeliais, turinčiais mažą elektrostatinį paviršiaus potencialą (todėl negalinčiais sudrėkinti paviršiaus).Priešingai, αS / Tau lašeliai yra mažiau veiksmingi optimizuojant lašelių krūvio balansą dėl sudėtingesnių baltymų tinklų (su homotipine ir heterotipine sąveika) ir dėl silpnesnio baltymų sąveikos pobūdžio.Dėl to susidaro lašeliai, kurie ilgą laiką išlaiko skysčio elgseną ir turi didelį elektrostatinį paviršiaus potencialą, kuris linkęs sumažinti susiliejus ir augant (taip sumažinant lašelių paviršiaus ploto ir tūrio santykį) ir drėkinant hidrofilinį paviršiaus chemiją.Tai sukuria dideles koncentruotas baltymų bibliotekas, kurios išlaiko skysčių savybes, nes sąveika išlieka labai trumpalaikė dėl nuolatinės įkrovos optimizavimo paieškos baltymų tinkle.Įdomu tai, kad N-galu sutrumpintos Tau formos, įskaitant kai kurias natūraliai atsirandančias izoformas62, pasižymi vidutiniu elgesiu, kai kurios su αS sensta į ilgai išliekančius gelio pavidalo lašelius, o kitos virsta dideliais skystais kondensatais.Šis αS elektrostatinių koacervatų brendimo dvilypumas atitinka naujausius LLPS teorinius ir eksperimentinius tyrimus, kuriuose nustatyta koreliacija tarp valentinio išeikvojimo ir elektrostatinio sijojimo kondensatuose kaip raktas į kondensato dydį ir skysčio savybes.Mechanizmas 58.61.
Ši schema rodo galimą αS ir Tau441 amiloido agregacijos kelią per LLPS ir LSPT.Su papildomais anijonais turtingais (raudonais) ir katijonais (mėlynais) regionais, αS ir tau elektrostatiniai koacervatai, turintys patenkinamą valentingumą, turi mažesnę paviršiaus energiją ir todėl mažiau susilieja, todėl lašeliai greitai sensta.Pasiekiama stabili neaglomeruota gelio būsena..Ši situacija yra labai palanki αS / pLK sistemos atveju dėl didesnio afiniteto ir paprastesnio baltymų porų sąveikos tinklo, kuris leidžia greitai pereiti į gelį.Priešingai, nepatenkinamo valentingumo lašeliai ir todėl sąveikai prieinamos baltymais įkrautos sritys palengvina koacervatui susilieti ir sudrėkinti hidrofilinį paviršių, kad sumažėtų jo didelė paviršiaus energija.Ši situacija yra tinkamesnė αS / Tau441 koacervatams, kurie turi daugiavalentį sudėtingą tinklą, susidedantį iš silpnų Tau-Tau ir αS-Tau sąveikų.Savo ruožtu didesni koacervatai lengviau išsaugos į skysčius panašias savybes, todėl gali atsirasti kitų baltymų ir baltymų sąveikos.Galiausiai koacervatiniame skystyje susidaro heterogeniniai amiloido agregatai, kuriuose yra ir αS, ir tau, kurie gali būti susiję su inkliuziniuose kūnuose, kurie yra neurodegeneracinių ligų požymiai.
Didelės į skystį panašios struktūros, susidarančios brendant αS / Tau441 su labai perpildyta, bet dinamiška baltymų aplinka ir, mažesniu mastu, αS / ΔNt-Tau koacervatai yra idealūs rezervuarai baltymų agregacijos branduoliui formuoti.Mes iš tikrųjų stebėjome kietų baltymų agregatų susidarymą tokio tipo baltymų koacervatuose, kuriuose dažnai yra ir αS, ir tau.Mes parodėme, kad šiuos heteroagregatus stabilizuoja neelektrostatinė sąveika, jie gali surišti amiloidui būdingus ThT dažus taip pat, kaip ir tipinės amiloidinės fibrilės, ir iš tiesų turi panašų atsparumą įvairiems poveikiams.Įrodyta, kad LLPS suformuoti αS / tau agregatai turi amiloidą panašių savybių.Iš tiesų, brandus Tau variantas, kuriam trūksta amiloido agregacijos, yra labai sutrikęs, kai susidaro šie heterogeniniai αS agregatai skystame elektrostatiniame koacervete.αS/Tau441 agregatų susidarymas buvo stebimas tik koacervatų viduje, kurie išlaikė į skystį panašias savybes, ir niekada, jei koacervatai/lašeliai nepasiekė gelio būsenos.Pastaruoju atveju padidėjęs elektrostatinės sąveikos stiprumas ir dėl to baltymų tinklo standumas neleidžia atlikti būtinų konformacinių baltymų pertvarkymų, kad būtų sukurtos naujos baltymų sąveikos, reikalingos amiloido branduoliui susidaryti.Tačiau tai galima pasiekti naudojant lankstesnius, į skystį panašius koacervatus, kurie savo ruožtu greičiausiai išliks skysti, kai padidės.
Tai, kad agregatų susidarymas kondensuotoje fazėje yra geresnis dideliuose αS / Tau kondensatuose, o ne mažuose lašeliuose, kurie greitai želia, pabrėžia, kad svarbu nustatyti veiksnius, kurie kontroliuoja lašelių susiliejimą.Taigi, ne tik fazių atskyrimo tendencija, bet ir kondensato dydis turi būti kontroliuojamas, kad jis tinkamai veiktų ir būtų išvengta ligų58, 61.Mūsų rezultatai taip pat pabrėžia LLPS ir LSPT pusiausvyros svarbą αS / Tau sistemai.Nors lašelių susidarymas gali apsaugoti nuo amiloido agregacijos, sumažindamas baltymų monomerų kiekį prisotinimo sąlygomis, kaip buvo pasiūlyta kitose sistemose 63, 64 , lašelių susiliejimas esant dideliam lašelių lygiui gali sukelti vidinę baltymų agregaciją dėl lėto konformacinio pertvarkymo.baltymų tinklai..
Apskritai, mūsų duomenys labai pabrėžia darnios valencijos ir patenkintų / nepatenkintų sąveikų svarbą kritimo tinkluose LSPT kontekste.Visų pirma, parodome, kad viso ilgio αS / Tau441 kondensatai gali efektyviai susilieti ir sudaryti branduolius, sudarydami į amiloidą panašius heteroagregatus, kurie apima abu baltymus ir siūlo molekulinį mechanizmą, pagrįstą mūsų eksperimentiniais rezultatais.Dviejų baltymų koagregacija αS/Tau skysčio koacervate, apie kurį mes čia pranešame, iš tikrųjų gali būti susijęs su dviejų baltymų lokalizavimu inkliuzuose, kurie yra ligos požymiai, ir gali padėti suprasti ryšį tarp LLPS ir amiloido agregacija, atverianti kelią labai įkrautam IDP neurodegeneracijoje.
Monomeriniai WT-αS, cisteino mutantai (Q24C-αS, N122C-αS) ir ΔCt-αS variantai (Δ101-140) buvo išreikšti E. coli ir išgryninti, kaip aprašyta anksčiau.5 mM DTT buvo įtrauktas į visus αS cisteino mutantų gryninimo etapus, kad būtų išvengta disulfidinės jungties susidarymo.Tau441 izoforma (plazmidė, gauta iš Addgene #16316), ΔNt-Tau variantas (Δ1–150, gautas klonuojant IVA su pradmenimis CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) ir AggDEf1-2CTTamer išgrynintas (GGDEF1,25) E. coli kultūros buvo išaugo iki OD600 = 0,6–0,7 esant 37 ° C ir 180 aps./min., o ekspresija buvo sukelta IPTG 3 valandas 37 ° C temperatūroje.Surinkite ląsteles 11 500 xg 15 min 4 °C temperatūroje ir nuplaukite fiziologiniu buferiu, kuriame yra 150 mM NaCl.Pakartotinai suspenduokite nuosėdas lizės buferyje (20 ml 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidinas 50 μM, 00 copeptin1M).Ultragarsinis apdorojimas buvo atliktas ant ledo, kurio amplitudė buvo 80% 10 impulsų (1 min. įjungta, 1 min. išjungta).Vieno ultragarso tyrimo metu neviršykite 60 ml.E. coli lizatai kaitinami 95 °C temperatūroje 20 minučių, po to atšaldomi ant ledo ir centrifuguojami 127 000 x g 40 minučių.Nuskaidrintas supernatantas buvo uždėtas ant 3,5 kDa membranos (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, JK) ir dializuojamas prieš 4 l dializės buferio (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM). , PMSF 0,1 mM) 10 valandų.5 ml katijonų mainų kolonėlė (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, JAV) buvo subalansuota pusiausvyros buferiu (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau lizatas buvo filtruojamas per 0, 22 μm PVDF filtrą ir įšvirkščiamas į kolonėlę 1 ml / min srauto greičiu.Eliucija buvo vykdoma palaipsniui, tau buvo išplautas 15–30% eliuavimo buferiu (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Frakcijos buvo analizuojamos SDS-PAGE ir visos frakcijos, turinčios vieną juostą su numatoma tau molekuline mase, buvo sukoncentruotos naudojant 10 kDa centrifuginį filtrą ir pakeistos buferiu, kuriame yra 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM ir DTT 2 mM. galutinė baltymų koncentracija buvo 100 μM.Tada baltymų tirpalas buvo praleistas per 0, 22 μm PVDF filtrą, greitai užšaldomas ir laikomas -80 ° C temperatūroje.Proteiną K18 maloniai parūpino prof. Alberto Boffi.Preparato grynumas buvo >95%, kaip patvirtino SDS-PAGE ir MALDI-TOF/TOF.Įvairūs cisteinai buvo chemiškai pažymėti AlexaFluor488-maleimidu (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, JAV) arba TEMPOL-maleimidu (Toronto Research Chemicals, Torontas, Kanada).buvo patvirtinti absorbcija ir MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ir K18 buvo paženklinti natūraliomis cisteino liekanomis 191 ir 322 padėtyse, naudojant Atto647N-maleimidą (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Vokietija), taikant tą pačią procedūrą.Grynasis mokestis už likutį αS ir Tau441 buvo sukurtas naudojant CIDER66.
Kietas poli-L-lizinas (pLK DP 90-110 pagal BMR iš tiekėjo, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, JAV) buvo ištirpintas 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH nuo 7,4 iki 10 mM, procesas apdorotas ultragarsu 5 minučių ultragarsinėje vandens vonioje ir laikyti -20°C temperatūroje.PEG-8, dekstranas-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, JAV) ir FITC-dekstranas-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, JAV) yra tirpūs vandenyje ir plačiai paplitę LLPS buferyje.Dializės metu pašalinamos užterštos druskos.Tada jie buvo filtruojami per švirkšto filtrą, kurio porų dydis buvo 0, 22 μm, o jų koncentracija buvo apskaičiuota naudojant refraktometrą (Mettler Toledo, Kolumbas, Ohajas, JAV).LLPS mėginiai buvo paruošti kambario temperatūroje tokia tvarka: buferis ir ekstruzija buvo sumaišyti ir 1 mM tris(2-karboksietil)fosfino (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(etano- 1,2-diildinitrilas) tetraacto rūgštis (EDTA, karboksintas) ir 1% proteazės inhibitoriaus mišinys (PMSF 100 mM, benzimidas 1 mM, leupeptinas 5 μM).Tada pridedami αS ir sulieti polikatijonai (parinktys pLK arba Tau).Tioflavino-T laiko eilučių eksperimentams (ThT, Carbosynth, Compton, JK) naudokite bendrą ThT koncentraciją, kad ji būtų pusė αS koncentracijos.Švelniai, bet kruopščiai sumaišykite mėginius, kad jie būtų vienalyčiai.Kiekvieno komponento koncentracija kiekviename eksperimente skyrėsi, kaip aprašyta skyriuje „Rezultatai“.Azidas buvo naudojamas 0,02 % (m/v) koncentracija, kai eksperimento trukmė viršijo 4 valandas.Atliekant visas analizes naudojant LLPS mėginius, prieš analizę leiskite mišiniui nusibalansuoti 5 minutes.Šviesos sklaidos analizei 150 µl mėginių buvo įdėta į neprisirišančias 96 šulinėlių mikroplokštes (µClear®, juoda, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austrija) ir padengta lipnia plėvele.LLP buvo stebimi matuojant absorbciją esant 350 nm tirpalo centre CLARIOstar plokštelių skaitytuve (BMG Labtech, Ortenberg, Vokietija).Eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais 25 ° C temperatūroje, o paklaidos buvo apskaičiuotos kaip standartinis nuokrypis nuo vidurkio.Praskiesta fazė buvo kiekybiškai įvertinta mėginio centrifugavimu ir SDS-PAGE gelio analize, o αS frakcija praskiestoje ir koncentruotoje fazėje buvo kiekybiškai įvertinta įvairiuose LLPS tirpaluose.100 μl LLPS mėginys, kuriame yra 1 μM AF488 pažymėto αS, buvo paruoštas kruopščiai sumaišant, po to centrifuguojant 9600 × g 30 minučių, o po to paprastai buvo matomos nuosėdos.Viršutinė 50 μl supernatanto buvo naudojama baltymų kiekybiniam nustatymui naudojant SDS-PAGE gelį.Geliai buvo nuskaityti AF488 filtrais naudojant ChemiDoc gelio vaizdavimo sistemą (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, JAV) arba nudažyti Coomassie dėme ir vizualizuoti atitinkamais filtrais.Gautos juostos buvo analizuojamos naudojant ImageJ 1.53i versiją (Nacionaliniai sveikatos institutai, JAV).Eksperimentai buvo atlikti dviem egzemplioriais dviem skirtingais eksperimentais su panašiais rezultatais.
Paprastai 150 μl mėginių buvo dedama ant neprisirišančių 96 šulinėlių mikroplokštelių ir vizualizuojama kambario temperatūroje apverstu Leica DMI6000B mikroskopu (Leica Microsystems, Wetzlar, Vokietija).Taškiniams eksperimentams taip pat buvo naudojamos µ-Slide Angiogenesis plokštelės (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Vokietija) arba 96 šulinėlių polistireno mikroplokštelės (Corning Costar Corp., Acton, Masačusetsas).EL6000 halogeninės arba gyvsidabrio metalo halogeninės lempos buvo naudojamos kaip apšvietimo šaltiniai (atitinkamai BF / DIC ir WF vaizdavimui).WF mikroskopijai buvo naudojamas 40 kartų padidinamas oro objektyvas (Leica Microsystems, Vokietija), kad sufokusuotų šviesą į mėginį ir paimtų.AF488 ir ThT pažymėtiems mėginiams filtruokite sužadinimą ir emisiją su standartiniais GFP filtrų rinkiniais, atitinkamai sužadinimo ir emisijos pralaidumo filtrais, 460–500 nm ir 512–542 nm pralaidumo filtrais ir 495 nm dichroiniu veidrodžiu.Mėginiams, pažymėtiems Atto647N, buvo naudojamas standartinis Cy5 filtrų rinkinys su atitinkamai 628–40 nm ir 692–40 nm sužadinimo ir emisijos pralaidumo filtrais bei 660 nm dichroinis veidrodis.BF ir DIC mikroskopijai naudokite tą patį atspindėtos šviesos rinkimo objektyvą.Surinkta šviesa buvo įrašyta Leica DFC7000 CCD kamera (Leica Microsystems, Vokietija).Ekspozicijos laikas buvo 50 ms atliekant BF ir DIC mikroskopinį vaizdavimą ir 20–100 ms atliekant WF mikroskopinį vaizdą.Palyginimui, visų eksperimentų su ThT ekspozicijos laikas buvo 100 ms.Buvo atlikti laiko intervalo eksperimentai, siekiant vizualizuoti lašelių susiliejimą, kai vaizdai buvo renkami kas 100 ms keletą minučių.Vaizdo analizei buvo naudojamas ImageJ (NIH, JAV).Eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais su panašiais rezultatais.
Kolokalizacijos eksperimentams, FRAP ir 3D rekonstrukcijai vaizdai buvo gauti Zeiss LSM 880 apverstu konfokaliniu mikroskopu, naudojant ZEN 2 mėlyną leidimą (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Vokietija).50 µl mėginiai buvo dedami ant µ-Slide Angiogenesis Petri lėkštelių (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Vokietija), apdoroti hidrofiliniu polimeru (ibiTreat) ir sumontuoti 63 × panardinamajame į aliejų objektyve (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4 Oil). DIC).Vaizdai buvo gauti naudojant 458 nm, 488 nm ir 633 nm argono lazerio linijas, kurių skiriamoji geba yra 0,26 µm/pikselis ir ekspozicijos laikas 8 µs/pikselis, kai sužadinimo ir emisijos aptikimo langai yra 470–600 nm, 493–628 nm. ir 638–755 nm buvo naudojami atitinkamai ThT, AF488 ir Atto647N vizualizuoti.Atliekant FRAP eksperimentus, kiekvieno mėginio fotografavimas buvo užfiksuotas 1 kadru per sekundę.Eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais kambario temperatūroje su panašiais rezultatais.Visi vaizdai buvo analizuojami naudojant Zen 2 blue edition programinę įrangą (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Vokietija).FRAP kreivės buvo normalizuotos, nubraižytos ir pritaikytos intensyvumo / laiko duomenims, išgautiems iš vaizdų naudojant Zen 2, naudojant OriginPro 9.1.Atkūrimo kreivės buvo pritaikytos monoeksponentiniam modeliui, kad būtų atsižvelgta į molekulinę difuziją su papildomu eksponentiniu terminu, kad būtų atsižvelgta į įgijimo balinimo efektą.Tada apskaičiavome D, naudodami nominalų balinimo spindulį ir anksčiau nustatytą atkūrimo pusinės eliminacijos laiką, kaip nurodyta Kang ir kt.Rodoma 5 35.
Pavieniai αS cisteino variantai buvo susintetinti su 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksilu (TEMPOL) 24 (TEMPOL-24-αS) ir 122 (TEMPOL-122-αS) padėtyse, atitinkamai.Sukimo žymėjimas EPR eksperimentams αS koncentracija buvo nustatyta 100 μM, o PEG koncentracija buvo 15 % (m/t).Esant įvairioms agregacijos sąlygoms, αS: pLK santykis buvo 1:10, o αS: ΔNt-Tau ir αS: Tau441 santykis buvo 1:1.Atliekant surišimo titravimo eksperimentus, kai nebuvo susikaupimo, TEMPOL-122-αS buvo palaikomas 50 μM, o polikatijonai buvo titruojami didėjančiomis koncentracijomis, ruošiant kiekvieną sąlygą atskirai.CW-EPR matavimai buvo atlikti naudojant Bruker ELEXSYS E580 X-band spektrometrą su Bruker ER4118 SPT-N1 rezonatoriumi, veikiančiu mikrobangų (SHF) dažniu ~9,7 GHz.Temperatūra buvo nustatyta 25 ° C ir kontroliuojama skysto azoto kriostatu.Spektrai buvo gauti nesočiomis sąlygomis esant 4 mW MW galiai, 0,1 mT moduliacijos amplitudei ir 100 kHz moduliacijos dažniui.Spektro intensyvumas buvo normalizuotas, kad būtų išvengta sukimosi koncentracijų skirtumų tarp mėginių ir galimo sukimosi sumažėjimo dėl likutinės redukuojančių medžiagų koncentracijos mėginiuose, kuriuose yra Tau441 arba ΔNt-Tau (esančių pradiniuose baltymų tirpaluose).Pateiktos g reikšmės buvo gautos EPR spektrinio modeliavimo, atlikto naudojant Easyspin programinę įrangą (v. 6.0.0-dev.34), įdiegtą Matlab®67, rezultatas.Duomenims modeliuoti buvo naudojami vieno/dviejų komponentų izotropiniai modeliai.Normalizavus visus signalus, likučiai buvo apskaičiuoti atimant kiekvieną modeliavimą iš atitinkamo eksperimentinio spektro.Ryšio titravimo analizei buvo naudojamas trečiosios juostos santykinis intensyvumas normalizuoto EPR spektro antrajai juostai (IIII / III), siekiant stebėti polikatijonų prisijungimą prie αS.Norint įvertinti disociacijos konstantą (Kd), gauta kreivė buvo pritaikyta apytiksliui modeliui, darant prielaidą, kad n identiškų ir nepriklausomų surišimo vietų.
BMR spektroskopijos eksperimentai buvo atlikti naudojant Bruker Neo 800 MHz (1H) BMR spektrometrą su kriozondu ir Z gradientu.Visi eksperimentai buvo atlikti naudojant 130–207 µM αS ir atitinkamus αS/ΔNt-Tau ir pLK ekvivalentus 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 % DO, pH 7,4 ir buvo atlikti 15 °C temperatūroje.Norint stebėti LPS pagal BMR, į iš anksto sumaišytus mėginius buvo pridėta 10% PEG.Cheminio poslinkio trikdžių diagrama (1b pav.) rodo vidutinius 1H ir 15N cheminius poslinkius.αS 2D1H-15N HSQC spektrai buvo priskirti remiantis ankstesne priskyrimu (BMRB įrašas Nr. 25227) ir patvirtinti įrašant ir analizuojant HNCA, HNCO ir CBCAcoNH 3D spektrus.13Cα ir 13Cβ cheminiai poslinkiai buvo apskaičiuoti esant ΔNt-Tau arba pLK, kad būtų galima išmatuoti galimus antrinės struktūros tendencijų pokyčius, palyginti su αS cheminiais poslinkiais grynoje atsitiktinės ritės konformacijoje 68 (papildomas 5c paveikslas).R1ρ dažniai buvo išmatuoti registruojant hsqctretf3gpsi eksperimentus (gautus iš Bruker bibliotekos) su 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 ir 800 ms vėlavimais, o eksponentinės funkcijos buvo pritaikytos prie skirtingo intensyvumo vėlavimo piko. kartų, kad būtų galima nustatyti R1ρ ir jo eksperimentinę neapibrėžtį.
Dviejų spalvų laiko skiriamosios gebos fluorescencinės mikroskopijos eksperimentai buvo atlikti komerciniu laiko skiriamuoju MT200 fluorescenciniu konfokaliniu mikroskopu (PicoQuant, Berlynas, Vokietija) su laiku koreliuojančiu vieno fotonų skaičiavimo (TCSPC) įrenginiu.Lazerinio diodo galvutė naudojama impulsiniam interleaved sužadinimui (PIE), spindulys praeina per vieno režimo bangolaidį ir yra sureguliuotas į 10–100 nW lazerio galią 481 nm ir 637 nm lazerio linijoms, išmatuotoms po dichroinio veidrodžio.Tai užtikrina optimalų fotonų skaičiavimo greitį, išvengiant fotonų paklaidos, fotobalinimo ir prisotinimo.μ-Slide angiogenezės dengiamosios plokštelės arba plokštelės (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Vokietija) buvo dedamos tiesiai į panardinamąjį vandenį virš Super Apochromat 60x NA 1.2 objektyvo su korekcine apykakle (Olympus Life Sciences, Waltham, JAV).Kaip pagrindinio pluošto skirstytuvas buvo naudojamas 488/640 nm dichroinis veidrodis (Semrock, Lake Forest, IL, JAV).Nefokusuota spinduliuotė blokuojama 50 mikronų skersmens skylute, tada sufokusuota spinduliuotė 50/50 pluošto dalikliu padalijama į 2 aptikimo kelius.Prieš detektorių buvo naudojami juostiniai emisijos filtrai (Semrock, Lake Forest, IL, JAV) 520/35 žaliam dažui (AF488) ir 690/70 raudonam dažui (Atto647N).Kaip detektoriai buvo naudojami vieno fotono lavinų diodai (SPAD) („Micro Photon Devices“, Bolzanas, Italija).Duomenų rinkimas ir analizė buvo atlikti naudojant komerciškai prieinamą SymphoTime64 programinę įrangą (PicoQuant GmbH, Berlynas, Vokietija).
Penkiasdešimt mikrolitrų LLPS mėginių buvo dedami į μ-Slide angiogenezės šulinius (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Vokietija).Gauti vaizdai sufokusuojami iki 20 µm virš šulinio dugno, kad būtų optimalus objektyvo veikimo atstumas, kai pakabinami lašeliai, ir iki ~ 1 µm, kai yra plaustų ir taškų, kurių ašinė skiriamoji geba yra bent 0,25 µm/pikselis ir 400 µs/pikselio delsos laikas.Pasirinkite duomenis taikydami intensyvumo slenkstį, pagrįstą vidutiniu fono signalo intensyvumu (PBG, vidurkis + 2σ) kiekvienam kanalui, kad būtų pasirinkti tik skystų baltymų lašeliai, plaustai arba dėmės, išfiltruojant bet kokią galimą išsklaidytos fazės kilmę.Norėdami išanalizuoti kiekvieno kanalo kiekvienos rūšies (τ) gyvavimo trukmę (žalia, "g" - AF488 ir raudona, "r" - Atto647N), pasirinkome dominančius regionus (ROI), kuriuose yra lašelių, plaustų ar dėmių (papildomas 1 paveikslas). ).8b) ir išvedė juos pritaikydami jų gyvavimo trukmę (atitinkamai τD, τR ir τP lašeliams, plaustams ar dėmėms, žr. papildomą 8c pav.) kiekviename kanale, naudodami uodegos pritaikymo analizę ir dviejų komponentų skilimo modelį.Vidutinis τ nuo τ .ROI, kurios pagamino per mažai fotonų, kad būtų galima pritaikyti daugialypį eksponentinį derinį, nebuvo įtrauktos į analizę.Naudota ribinė riba buvo <104 fotonai plaustams ir taškams ir 103 lašams.Lašelių slenkstis yra žemesnis, nes sunku gauti skilimo kreives su didesnėmis intensyvumo reikšmėmis, nes lašeliai vaizdo lauke paprastai yra mažesni ir jų yra mažiau.ROI, kurių fotonų skaičius viršija fotonų kaupimosi ribą (nustatytas > 500 skaitmenų / pikselis), taip pat buvo atmestos analizei.Intensyvumo mažėjimo kreivę, gautą iš dominančio regiono, suderinkite su 90 % maksimalaus intensyvumo (šiek tiek po didžiausio slopinimo intensyvumo) nuo eksploatavimo pradžios, kad užtikrintumėte minimalius IRF trukdžius, išlaikant vienodą viso intensyvumo slopinimo atveju. nustatymai Santykinis laiko langas Buvo ištirta nuo 25 iki 50 ROI dėl plaustų ir dėmių ir nuo 15 iki 25 ROI dėl lašų, ​​vaizdai atrinkti iš daugiau nei 4 pakartojimų, įrašytų iš mažiausiai 3 nepriklausomų eksperimentų.Dviejų pusių t testai buvo naudojami statistiniams skirtumams tarp rūšių arba tarp koacervinių sistemų įvertinti.Atliekant veikimo trukmės analizę po pikselius (τ), buvo apskaičiuotas bendras kiekvieno kanalo veikimo trukmės slopinimas lauke ir atliktas 2/3 komponento eksponentinės slopinimo modelio apytikslis įvertinimas.Tada kiekvieno pikselio eksploatavimo trukmės slopinimas buvo pritaikytas naudojant anksčiau apskaičiuotas τ reikšmes, todėl buvo sukurtas pseudocolor FLIM tinkamas vaizdas.Tinkamo uodegos veikimo trukmė buvo vienoda visuose to paties kanalo vaizduose, o kiekvienas skilimas sukūrė pakankamai fotonų, kad būtų užtikrintas patikimas atitikimas.FRET analizei pikseliai buvo atrinkti taikant mažesnį 100 fotonų intensyvumo slenkstį, kuris vidutiniškai sudarė 11 fotonų fono signalą (FBG).Kiekvieno kanalo fluorescencijos intensyvumas koreguotas eksperimentiškai nustatytais pataisos koeficientais: 69 spektrinio skersinio perkalbėjimo α – 0,004, tiesioginio sužadinimo β – 0,0305, aptikimo efektyvumo γ – 0,517.Tada FRET efektyvumas pikselių lygyje apskaičiuojamas naudojant šią lygtį:
kur FDD yra fluorescencijos intensyvumas, stebimas donoro (žaliajame) kanale, FDA yra fluorescencijos intensyvumas, stebimas akceptoriaus (raudonajame) kanale esant netiesioginiam sužadinimui, o FAA yra fluorescencijos intensyvumas, stebimas akceptoriaus (raudonajame) kanale esant tiesioginiam sužadinimui ( PYRAGAS).Kanale stebimi fluorescencijos intensyvumo impulsai).
100 µl LLPS reakcijos tirpalų, kuriuose yra 25 µM nežymėto monomerinio Tau441 (su 25 µM αS arba be jo) į LLPS buferį (papildyta, kaip nurodyta aukščiau) ant neprisirišančių 96 šulinėlių mikroplokštelių su lipnia folija padengta, o lašelių susidarymas buvo patikrintas WF mikrokopija. pusiausvyrą.per 10 min.Po 48 valandų inkubacijos kambario temperatūroje buvo patvirtinta, kad yra baltymų plaustų ir dėmių.Tada atsargiai pašalinkite skystį virš plaustų iš šulinių, tada įpilkite 50 l disociacijos buferio (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ir inkubuokite 10 min.Didelė druskos koncentracija užtikrina, kad LLPS nepasikartos dėl likusio PEG, o galimi baltymų mazgai, susidarę tik dėl elektrostatinės sąveikos, bus išardomi.Tada šulinėlio dugnas buvo atsargiai nugramdytas mikropipetės antgaliu ir gautas tirpalas perpilamas į tuščią stebėjimo šulinį.1 valandą inkubavus mėginius su 50 μM ThT, izoliuotų dėmių buvimas buvo patikrintas WF mikroskopu.Paruoškite ultragarsu apdorotas αS fibriles, 7 dienas inkubuodami 300 µl 70 µM αS tirpalo PBS, kurio pH 7,4, 0,01 % natrio azidu 37 °C temperatūroje ir 200 aps./min.Tada tirpalas centrifuguojamas 9600 x g 30 min., nuosėdos pakartotinai suspenduotos PBS pH 7,4 ir apdorotos ultragarsu (1 min., 50 % ciklas, 80 % amplitudė Vibra-Cell VC130 sonikatoriuje, Sonics, Niutonas, JAV) fibrilių mėginiai. su santykinai vienodu mažų fibrilių dydžio pasiskirstymu.
FCS / FCCS analizė ir dviejų spalvų sutapimų aptikimas (TCCD) buvo atlikti tuo pačiu MT200 laiko skiriamuoju fluorescenciniu konfokaliniu mikroskopu (Pico-Quant, Berlynas, Vokietija), kuris buvo naudojamas FLIM-FRET mikroskopijos eksperimentams naudojant PIE režimą.Šių eksperimentų lazerio galia buvo pridėta prie 6,0 µW (481 nm) ir 6,2 µW (637 nm).Šių lazerio galių derinys buvo pasirinktas siekiant sukurti panašų naudojamų fluoroforų porų ryškumą, tuo pačiu užtikrinant optimalų skaičiavimo greitį ir išvengiant fotobalinimo bei prisotinimo.Duomenų rinkimas ir analizė buvo atlikti naudojant komerciškai prieinamą SymphoTime64 2.3 versijos programinę įrangą (PicoQuant, Berlynas, Vokietija).
Išskirtų αS/Tau agregatų mėginiai, gauti naudojant LLPS, skiedžiami izoliaciniu buferiu iki atitinkamos monomolekulinės koncentracijos (paprastai skiedimas 1:500, nes agregatų koncentracija jau yra maža, kai išskiriama iš koacervato mėginių).Mėginiai buvo dedami tiesiai ant dengiamųjų stiklelių (Corning, JAV), padengtų BSA tirpalu, kurio koncentracija buvo 1 mg/ml.
Atliekant PIE-smFRET analizę žaliame ir raudoname kanaluose, buvo pritaikytas mažesnis 25 fotonų intensyvumo slenkstis, siekiant išfiltruoti mažo intensyvumo signalus, kuriuos sukelia monomeriniai įvykiai (atkreipkite dėmesį, kad monomerų yra daugiau nei agreguotų mėginių, palyginti su izoliuotais agregatais).Ši riba buvo apskaičiuota kaip penkis kartus didesnis už vidutinį monomerinio αS intensyvumą, gautą analizuojant grynų monomerų mėginius, siekiant konkrečiai parinkti agregatus analizei.PIE pavaros grandinė kartu su TSCPC duomenų gavimu leido pritaikyti visą gyvenimą trunkantį svorio filtrą, kuris padeda pašalinti foninį ir spektrinį skersinį pokalbį.Blyksnio intensyvumas, pasirinktas naudojant aukščiau nurodytas ribas, buvo pakoreguotas naudojant vidutinį foninį signalą, nustatytą pagal tik buferio mėginių atsiradimo ir intensyvumo / talpyklos histogramas.Su dideliais agregatais susietos serijos paprastai užima kelias iš eilės laiko žymes (nustatyta 1 ms).Tokiais atvejais buvo pasirinkta didžiausio stiprumo dėžė.FRET ir stechiometrinei analizei buvo naudojamas teoriškai nustatytas gama faktorius γ (0,517).Spektrinio skersinio pokalbio ir tiesioginio sužadinimo indėlis yra nereikšmingas (nustatomas eksperimentiniu būdu) esant naudojamai sužadinimo lazerio galiai.FRET efektyvumas ir stechiometrija sprogimo metu apskaičiuojami taip.