347 nerūdijančio plieno suvyniotų vamzdelių cheminis komponentas. Naujų į interferoną reaguojančių žmogaus leukocitų antigeno-A (HLA-A) chaperono baltymų identifikavimas naudojant kryžminę masių spektrometriją (CLMS)

Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojate naršyklės versiją su ribotu CSS palaikymu.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Be to, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stilių ir JavaScript.
Slankikliai, rodantys tris straipsnius vienoje skaidrėje.Norėdami pereiti per skaidres, naudokite mygtukus „Atgal“ ir „Kitas“ arba, norėdami pereiti per kiekvieną skaidrę, naudokite skaidrių valdiklio mygtukus pabaigoje.

Prekės aprašymas

Nerūdijančio plieno 347L ritės vamzdžiai, plieno klasė: SS347L

Interferono signalizacijos sistema sukelia stiprų citokinų atsaką į įvairius patogeninius ir būdingus patologinius signalus iš aplinkos, todėl indukuojami interferono indukuojamų baltymų pogrupiai.Taikėme DSS sukeltą kryžminio ryšio masės spektrometriją (CLMS), kad aptiktume naujas baltymų ir baltymų sąveikas interferono sukeltų baltymų srityje.Be tikėtinų interferono indukuojamų baltymų, mes taip pat nustatėme naujus tarpmolekulinius ir intramolekulinius susietus kanoninių interferonu indukuojamų baltymų, tokių kaip MX1, USP18, OAS3 ir STAT1, aduktus.Mes sutelkėme dėmesį į naujo interferono indukuojamų baltymų tinklų, sudarytų iš HLA-A baltymų (H2BFS-HLA-A-HMGA1), stačiakampio patvirtinimo, naudojant bendrą imunoprecipitaciją, ir tolesniam jų tyrimui naudojant molekulinės dinamikos modeliavimą.Baltymų komplekso konformacinės dinamikos modeliavimas atskleidė keletą sąveikos vietų, atspindinčių CLMS išvadose nustatytas sąveikas.Kartu pristatome bandomąjį CLMS tyrimą, skirtą nustatyti naujus interferono sukeltus signalizacijos kompleksus, ir tikimės, kad CLMS bus panaudota plačiau, siekiant nustatyti naują baltymų sąveikos dinamiką naviko mikroaplinkoje.
Prieš prasidedant adaptyviam imuniniam atsakui, šeimininko įgimta gynybos sistema sukuria antimikrobinį atsaką, kurį tarpininkauja išskiriamų alfa-spiralinių citokinų, vadinamų interferonais (IFN), šeima.I tipo IFN klasės IFNα ir IFNβ suaktyvina ląstelių atsakus, įskaitant antivirusines, proapoptotines, priešuždegimines ir antiproliferacines būsenas.Žmonėms yra žinomi 13 IFNα potipių, visi suskirstyti į 91 chromosomą. Keista, kad klinikiniam naudojimui buvo tiriama tik IFNα2.Neseniai buvo skiriamas ypatingas dėmesys kitiems IFNα potipiams tyrimams.Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad IFNα14 yra viena iš efektyviausių izoformų, ribojančių HBV2 ir ŽIV-13,4 replikaciją, palyginti su kanoniniu IFNα2 potipiu.
Nustatyta, kad aktyvuoti I tipo interferono receptorių kompleksai (IFNAR1 ir IFNAR2) sukelia Janus kinazių TYK2 ir JAK15,6 tarpininkaujamą signalo perdavimo kaskadą.Šios Janus kinazės fosforilina signalo keitiklius ir transkripcijos baltymų aktyvatorius (STAT1 ir STAT2) ant tirozino liekanų, kad inicijuotų SH2 domeno sukeltą heterodimerizaciją6.Vėliau IRF9 jungiasi su STAT heterodimerais, sudarydamas IFN stimuliuojamo 3 faktoriaus geno (ISGF3) trimerinį kompleksą, kuris persikelia į branduolį ir sukelia daugiau nei 2000 interferonu stimuliuojamų genų (ISG) transkripciją 5, 6, 7, 8.
ISG sudaro įgimtos imuninės sistemos stuburą, ypač reaguojant į viruso ataką.Kaip pirmoji gynybos linija nuo virusinės infekcijos, ląstelės greitai išnaudoja plačią ląstelių baltymų sąveiką su įvairia biologine veikla.Šie baltymai apima modelio atpažinimo receptorius, signalines molekules, transkripcijos faktorius ir baltymus, turinčius tiesioginių antivirusinių funkcijų, taip pat neigiamus imuninio atsako reguliatorius9.Didžioji dalis informacijos apie ISG aktyvumą gaunama iš funkcinių ekranų, kuriuose naudojami pernelyg didelės ekspresijos ekranai 10, 11 arba genų slopinimo metodai (siRNR, RNAi ir CRISPR) 12, 13, kuriuose atskiri ISG yra ekspresuojami arba slopinami ir jų aktyvumas išbandomas įvairiuose virusuose.Nors šie tyrimai nustatė atskirų ISG antivirusines savybes, kiekvieno ISG pagrindiniai molekuliniai mechanizmai iš esmės nežinomi.Visuotinai pripažįstama, kad daugelis baltymų sąveikauja su vienu ar daugiau citokinų, kad užtikrintų visišką aktyvumą, todėl arba ISG sąveikauja tiesiogiai, arba jų sąveiką tarpininkauja ląstelių baltymai.Pavyzdžiui, neseniai atliktas fotokryžminės proteomikos tyrimas nustatė, kad ATPazė VCP/p97 yra pagrindinis IFITM3 sąveikos partneris, kurio slopinimas sukelia lizosomų rūšiavimo, apyvartos ir IFITM3 bendro transportavimo su virusinėmis dalelėmis defektus14.Naudodami imunoprecipitaciją, nustatėme VAPA, su pūslelėmis susijusį baltymą, kaip sąveikos partnerį su IFITM1/2/3, kuris tarpininkauja cholesterolio sukeltam viruso brendimui, ir tai patvirtino kitas tyrimas, naudojant mielių dviejų hibridų sistemą.Mokslinė parama 15, 16.
Pagrindinis biologinis procesas, susijęs su infekcijos ir piktybinės transformacijos slopinimu, yra antigeno pateikimas, kurį tarpininkauja pagrindinės histokompatibilumo komplekso (MHC) molekulės.Peptidai (8–12 aminorūgščių ilgio) iš suskaldytų, per anksti nutrauktų ar netinkamai susilanksčiusių baltymų įkeliami į MHC-I heterodimerą (sudarytą iš MHC-I sunkiųjų ir lengvųjų grandinių, vadinamų β-2-mikroglobulinu; β2M) 17,18 .Gauti stabilūs MHC-I trimeriai pernešami į ląstelės paviršių, kur jie pateikia tarpląstelinius peptidus CD8+ T ląstelėms (citotoksinėms T ląstelėms)17.T ląstelės atpažįsta ir sunaikina šiuos patogenus ir ląsteles, turinčias navikui specifinį antigeną.Todėl patogenai ir naviko ląstelės dažnai slopina antigeno pateikimo procesą, kad išvengtų imuninės priežiūros.Be to, MHC-I yra sumažintas 40–90% žmogaus navikų ir dažnai yra susijęs su prastesne prognoze19.
Genai, dalyvaujantys reaguojant į patogenus, turi greitai persijungti iš ramybės būsenos į aktyvios transkripcijos būseną.Todėl manoma, kad keli ląstelių baltymai dalyvauja reaguojant į didelį IFN poreikį per trumpą laiką, įskaitant promotoriaus chromatino 20, 21 remodeliavimą ir modifikavimą.Dauguma tyrimų buvo skirti atskirų ISG baltymų partnerių identifikavimui esant IFN.Keletas proteominių ir transkriptominių tyrimų modelių ląstelių sistemose išaiškino IFN poveikį ląstelių kraštovaizdžiui.Tačiau, nepaisant augančio interferonų sukeltos dinamikos supratimo, mes vis dar mažai žinome apie ISG dalyvavimą.Svarstant interferono signalizacijos sudėtingumą ir nuo laiko priklausomą dinamiką, kyla du klausimai: (i) ar įmanoma stabilizuoti ir sulaikyti daugelio baltymų kompleksus, susijusius su greitu signalizavimu, ir (ii) ar šios sąveikos gali būti susietos su 3D erdve?
Norėdami išspręsti šias problemas, įgyvendinome disukcinimido suberato sukeltą cheminį kryžminį ryšį (DSS) kartu su masės spektrometrija (CLMS), kad ištirtume IFNα sukeltą baltymų sąveikos tinklą ir jo dinamiką.DSS prideda kovalentinius ryšius tarp proksimalinių baltymų ir (arba) baltymų kompleksų likučių in vivo.Vėlesnė MS analizė atskleidžia specifines kryžminio susiejimo vietas, kurios atspindi tam tikro baltymo regionų erdvinį artumą, vadinamus vidiniais ryšiais arba baltymų kompleksų subvienetais, vadinamais tarpusavio ryšiais.Taikydami šį metodą, mes nustatėme kelis naujus baltymų baltymų kompleksus, taip pat interferono sukeltus daugiaproteinų sąveikos tinklus.Toliau tirdami šių naujų sąveikų pogrupį, parodome, kad H2BFS (H2B histono tipo FS; toliau vadinama H2B) ir MDN1 veikia kaip HLA-A surišantys partneriai.
„Flo-1“ ląstelės yra viena iš geriausiai žinomų stemplės adenokarcinomos in vitro modelių, nes jos imituoja pagrindinius stemplės navikų bruožus22,23.Tačiau ne visi navikai yra imunogeniški, ir norėdami nustatyti, ar Flo-1 ląstelės reaguoja į gydymą interferonu, Flo-1 ląsteles gydėme 10 ng/ml IFNα 72 valandas.Flo-1 ląstelės parodė ankstyvą pSTAT1 ir IRF1 indukciją, prasidėjus 2 valandoms po gydymo ir tęsiant 72 valandas, su nuo laiko priklausomu stacionaraus IRF1 lygio sumažėjimu (1A pav.).Nustatyta, kad ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 ir ISG15) buvo stipriai indukuoti po 6 valandų, imituojant klasikinį vidutinės ir vėlyvosios fazės atsaką į IFNα (1A pav.).Kartu šie duomenys rodo, kad šis ląstelių modelis gali būti naudojamas tiriant interferono atsakus.
Skirtingi baltymų ekspresijos atsakai Flo-1 ląstelėse po gydymo IFNα.(A) Baltymų ekspresija Flo-1 ląstelėse, apdorotose 10 ng/ml IFNα 2, 6, 24, 48 ir 72 valandas, buvo analizuojama imunoblotu, naudojant nurodytus ISG antikūnus.(B) Coomassie mėlyna dažyti SDS-PAGE geliai iš visų ląstelių ekstraktų po kryžminio susiejimo su DSS nurodytu laiku ir koncentracijomis.(C) Reprezentatyvus imunoblotas, ištirtas naudojant p53 (DO-1) antikūnus iš tų pačių mėginių, siekiant įvertinti baltymų kryžminio susiejimo laipsnį.
Norėdami užfiksuoti in situ baltymų sąveikos kraštovaizdį, naudojome DSS, plačiai naudojamą kryžminio ryšio agentą dėl didelio membranos pralaidumo ir palyginti trumpo reakcijos laiko.Trumpesnis reakcijos laikas padeda išvengti didelių susietų baltymų agregatų susidarymo, taip išlaikant kryžminio ryšio stabilumą.Norėdami nustatyti optimalią DSS koncentraciją ir išvengti per didelio kryžminimo, pirmiausia ląsteles paveikėme 5, 2,5 ir 1 mM DSS atitinkamai 5, 10, 5 ir 30 minučių, o lizatus analizavome Coomassie dažytu SDS-PAGE. (duomenys neskelbtini).Atrodo, kad ląstelių lizatai yra labai susieti esant mažiausia koncentracijai ir trumpiausiu laiko momentu.Todėl DSS buvo titruotas iki 1, 0,5 ir 0,1 mM per 5 minutes (1B pav.).Optimalus kryžminis susiejimas buvo stebimas naudojant 0, 5 mM DSS 5 minutes, ir šios sąlygos buvo pasirinktos ląstelėms, apdorotoms IFNα.Be to, 1C paveiksle parodytas Western blot tyrimas, atliktas naudojant p53 (DO-1) antikūną, siekiant įvertinti baltymų kryžminio susiejimo laipsnį.
„Flo-1“ ląstelės 24 valandas buvo apdorotos 10 ng/ml IFNα prieš pridedant kryžminį ryšį.Vėliau susietos ląstelės buvo lizuojamos dviejų žingsnių proteolize, o baltymai buvo apdoroti FASP (2 pav.) 24,25.Kryžminiai triptiniai peptidai buvo analizuojami masės spektrometrijos metodu (2 pav.).Tada MS/MS spektrai suderinami su baltymų seka ir kiekybiškai įvertinami naudojant MaxQuant26,27.Iš gautų spektrų naudojant SIM-XL programą buvo identifikuoti kryžminiai peptidai, o atskiri junginiai sujungti į kompleksinį tinklą naudojant xQuest28 ir SIM-XL29 atvirojo kodo skaičiavimo programinės įrangos vamzdynus (2 pav.).SIM-XL identifikuoja baltymų ir baltymų sąveiką, vidines grandines ir atskiras grandines paprastuose ar sudėtinguose baltymų mišiniuose ir pateikia scenarijus, skirtus baltymų struktūrų sąveikai vizualizuoti.Be to, kiekviena kryžminė nuoroda vertinama kaip ID balas pagal MS/MS29 spektro kokybę.Buvo nustatytos kelios labai patikimos baltymų ir baltymų sąveikos ir kompleksai, toliau tirtas naujas sąveikų rinkinys, taikant ko-imunoprecipitaciją ir kompleksų konformacinius pokyčius, taikant molekulinės dinamikos (MD) modeliavimą (2 pav.) 30, 31.
CLMS metodo schema.Flo-1 ląstelės buvo apdorotos 10 ng/ml IFNα 24 valandas, po to in situ baltymų kryžminis susiejimas naudojant DSS, po to ląstelių lizė ir tripsinizacija.Kryžminiai mėginiai buvo analizuojami naudojant Orbitrap masės spektrometrą ir toliau imami mėginiai, siekiant suskaidyti peptidų pirmtakus LC-MS/MS metu.Iš gautų spektrų buvo nustatyti du susieti peptidai, naudojant kryžminių peptidų spektro atpažinimo mašiną (SIM-XL), o visi junginiai buvo sujungti į sudėtingą tinklą naudojant skaičiavimo vamzdynus.Išfiltruokite žemo patikimumo sąveikas pagal klaidingų teigiamų rezultatų rodiklio (FDR) balus.Kelios naujos didelio tikslumo baltymų ir baltymų sąveikos buvo toliau patvirtintos naudojant bendrą imunoprecipitaciją, o kompleksų konformaciniai pokyčiai buvo ištirti naudojant molekulinės dinamikos (MD) modeliavimą.
Iš viso ~ 30 500 ir ~ 28 500 peptidų buvo aptikta naudojant MaxQuant atitinkamai nestimuliuotuose ir stimuliuojamuose IFNα mėginiuose (papildoma S1 lentelė, 3A pav.).Peptidų ilgio pasiskirstymas abiem atvejais parodė didesnę didesnių peptidų dalį, o tai rodo, kad yra susietų peptidų (3B, C pav.).Be to, IFNα apdorotuose mėginiuose 40–55 diapazone buvo didesnė dalis didesnių peptidų (3c pav.).Baltymų kartografavimas pagal log2 intensyvumą parodė, kad klasikinių interferonu stimuliuotų baltymų buvo gausiausia, palyginti su neapdorotais mėginiais, įskaitant MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 ir HLA-F (3D pav.).Baltymų, daugiau nei tris kartus praturtintų reaguojant į gydymą IFNα, kelių analizė naudojant Reactome kelio duomenų bazę parodė, kad MHC-I sukeltas antigeno pateikimas ir apdorojimas buvo labiausiai dominuojantis kelias (3E pav.).Remiantis ankstesnėmis ataskaitomis, antivirusiniai atsakai, tarpininkaujantys OAS ir ISG15, taip pat IFNα / β ir citokinų signalizacija, buvo tarp aktyvuotų būdų.Be to, iš pradžių gautų MS / MS spektrų, naudojant SIM-XL, buvo nustatyti lizino ir serino specifiniai baltymų kryžminiai ryšiai.Neseniai atliktas tyrimas pranešė apie 104 ISG, apimančius 20 virusų iš 9 virusų klasių, atlikus atskirų ISG per didelės ekspresijos tyrimų 5 tipų ląstelėse metaanalizę9.Tačiau norėdami įveikti didelių duomenų rinkinių atrankos skaičiavimo apribojimus, pradėjome nuo mažesnio duomenų rinkinio, kad ištirtume galimas sąveikas tarp IRDS genų sąrašo, apie kurį pranešė Padaria ir kt., kurių dauguma yra ISG.
Skirtingai išreikštų kryžminių baltymų, reaguojančių į IFNα, identifikavimas (duomenys gauti iš MaxQuant).(A) Venno diagrama, vaizduojanti įprastų ir išskirtinių peptidų, nustatytų IFNα14 apdorotuose ir neapdorotuose Flo-1 mėginiuose, skaičių.Neapdorotų (B) ir IFNα apdorotų (C) susietų mėginių peptidų ilgio pasiskirstymas.(D) Šilumos žemėlapis, vaizduojantis log2 (LFQ intensyvumą) tarp neapdorotų ir IFNα14 apdorotų Flo-1 ląstelių.(E) Histograma, vaizduojanti 20 pagrindinių sodrinimo būdų po gydymo IFNα.Reactome kelio duomenų bazė išanalizavo daugiau nei keturis kartus sureguliuotų į IFNα reaguojančių baltymų pokyčius.
Interferono sukelta ISG stimuliacija yra gerai dokumentuota, tačiau molekuliniu lygiu menkai suprantama, kaip šie baltymai pasiekia daugybę biologinių funkcijų.Mes ištyrėme baltymų sąveiką su dideliu patikimumo laipsniu tarp žinomų ISG.Įdomu tai, kad mes nustatėme tinklą, apimantį MX1, USP18, ROBO1, OAS3 ir STAT1 baltymus, kurie, reaguodami į gydymą IFNα, sudaro didelį kompleksą (4 pav., S2 lentelė) 32, 33, 34.Svarbiausia, kad ši sąveika buvo nustatyta visuose trijuose egzemplioriuose, gydytuose IFNα, ir neaptikta neapdorotuose mėginiuose, o tai rodo, kad jos susidarė konkrečiai reaguojant į gydymą IFNα.Yra žinoma, kad STAT1 transkripciniu būdu reguliuoja šių ISG ekspresiją, tačiau jo sąveika su ISG baltymų lygiu nebuvo ištirta.STAT1 kristalinė struktūra parodė, kad jo spiralinis domenas (CCD) nedalyvauja sąveikoje su DNR ar protomerais formuojant dimerus35.Šios α-spiralės sudaro spiralinę spiralės struktūrą, kuri sudaro daugiausia hidrofilinį paviršiaus plotą sąveikai atsirasti 35 .Savo CLMS duomenyse pastebėjome, kad dauguma sąveikų su STAT1 įvyko SH2 domene prieš CCD, jungiklio domeną arba C-galo uodegą (700–708 liekanos) (4A pav.).Ankstesnis tyrimas pranešė, kad USP18 jungiasi prie STAT2 CCD ir DNR surišimo domeno (DBD) ir yra įtrauktas į I tipo interferono receptoriaus IFNAR2 subvienetą, kad tarpininkautų I tipo interferono signalizacijos slopinimui24.Mūsų duomenys taip pat parodė, kad USP18 katalizinis domenas sąveikauja su STAT1 DBD (4A, D paveikslai), o tai rodo, kad tiek STAT1, tiek STAT2 gali atlikti vaidmenį pritraukiant USP18 į IFNAR2.
Baltymų ir baltymų ISG tinklas, nustatytas kryžminėse ląstelėse, apdorotose IFNα.(A) 2D sąveikos grafikas, rodantis baltymų ir baltymų sąveiką (sugeneruotas SIM-XL programoje), su linijomis, vaizduojančiomis tarpmolekulines sąveikas (kryžminio ryšio riba nustatyta į 3,5).Skirtingų tapatybių domenai žymimi jų spalva32: MX1 domenas, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) ir GED (569–660).OAS3 domenai: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) ir OAS1_C (903-108).Domenas ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) ir fn3 (777–864).STAT1 laukai: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) ir STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Apvalus kryžminių baltymų (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 ir STAT1) peržiūros priemonė su sąveika ir sąveika, pažymėta atitinkamai mėlyna ir raudona spalva.Kryžminio ryšio slenkstis buvo nustatytas 3,5.Taškinės diagramos rodo STAT1 sąveikos vietas su MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) ir OAS3 (F), taip pat K arba S sąveikos vietas tarp dviejų peptidų.Paveiksle kryžminio ryšio balo slenkstis nustatytas į 3,0.(G) įvairios sąveikos vietos tarp STAT1 ir OAS3 DI domenų, esančių ant jų baltymų struktūrų PyMol (PyMOL molekulinės grafikos sistema, 2.0 versija Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) ir OAS3 (pdb id: 4s3n34).) programa.
Žmonėms buvo aprašytos dvi USP18 izoformos: viso ilgio baltymas, kuris daugiausia yra branduolyje, ir izoforma be N-galinio domeno, USP18-sf, kuri tolygiai pasiskirsto citoplazmoje ir branduolyje36.Be to, buvo prognozuojama, kad N galas yra nestruktūrizuotas ir nereikalauja izopeptidazės aktyvumo ar ISG1537 surišimo.Dauguma mūsų tyrime nustatytų sąveikų buvo baltymo N gale, o tai rodo, kad šios sąveikos apima viso ilgio USP18 (4A, D pav.) ir todėl greičiausiai įvyksta branduolyje.Be to, mūsų duomenys taip pat rodo, kad N galas yra specializuotas baltymų ir baltymų sąveikai.IFNAR2 surišimo vieta yra tarp 312-368 liekanų, ir pažymėtina, kad nė vienas iš komplekso baltymų neprisijungia prie šios srities (4A pav.)37,38.Šie duomenys kartu rodo, kad IFNAR2 surišimo domeną naudoja tik receptoriaus baltymas.Be to, buvo nustatyta, kad tik OAS3 ir ROBO1 yra susiję su domenais, esančiais prieš N-galą ir IFNAR2 surišimo vietą (4A pav.).
ROBO1 priklauso imunoglobulino (Ig) transmembraninių signalinių molekulių šeimai ir susideda iš penkių Ig domenų ir trijų fibronektino (Fn) domenų ekstraląsteliniame regione.Po šių tarpląstelinių domenų yra membranos proksimalinė sritis ir viena transmembraninė spiralė 39. Nestruktūrizuota viduląstelinė sritis yra C-gale ir turi konservuotų sekos motyvų, kurie tarpininkauja jungiantis efektorinio baltymo39.Regionas, besitęsiantis nuo ~ 1100 iki 1600 aminorūgščių, dažniausiai yra netvarkingas.Mes nustatėme, kad MX1 sąveikauja su ROBO1 per Ig, Fn ir tarpląstelinius domenus, o dauguma sąveikų su STAT1 įvyksta tarp jo CCD, linkerio domeno ir ROBO1 C-galo (4A, E pav.).Kita vertus, sąveika su DI, DIII ir OAS3 linkerio regionais buvo paskirstyta visame ROBO1 baltyme (4 pav. A).
Oligoadenilato sintazės (OAS) baltymų šeima priima ir suriša tarpląstelinę dvigrandę RNR (dsRNR), patiria konformacinius pokyčius ir sintezuoja 2′,5′ susietus oligoadenilatus (2-5 As) 40 .Nustatyta, kad tarp trijų OAS OAS3 pasižymi didžiausiu afinitetu dsRNR ir susintetina mažiausiai 2-5 As, kurios gali aktyvuoti RNazę L ir taip apriboti viruso replikaciją41.OAS šeimą sudaro polimerazės beta (pol-β) tipo nukleotidų transferazės domenai.Ankstesni tyrimai parodė, kad C-galinio domeno (DIII) katalizinis aktyvumas priklauso nuo dsRNR surišančio domeno (DI), kuris reikalingas OAS342 aktyvavimui.Pastebėjome, kad OAS3 DI ir DII domenai sąveikauja su CCD ir maža jungties sritimi tarp SH2 ir STAT1 TAD (4A, F pav.).Uždengiant skirtingas kryžminio susiejimo vietas ant baltymų struktūros, paaiškėjo, kad sąveika tarp β-lapo ir DBD STAT1 kilpos ir atviros kišenės arba ertmės, kurią sudaro 60–75 likučiai OAS3 DI domene (4G pav.).Baltymų orientacija komplekse taip pat parodė, kad nė vienas iš sąveikų su OAS3 netrukdė DNR surišimo gebėjimui jos DI domene (S1 pav.).Mes taip pat stebėjome OAS1 ir MX1 ​​sąveiką visuose trijuose IFNα apdorotuose pasikartojimuose, kur vienas OAS1 domenas (taip pat kataliziškai aktyvus) sąveikavo su visais trimis MX1 domenais (S2A, B pav.).
MX baltymai yra didelės į dyneiną panašių GTPazių šeimos dalis, kurioje yra N-galo GTPazės domenas, jungiantis ir hidrolizuojantis GTP, tarpinis domenas, kuris tarpininkauja savaiminiam susijungimui, ir C-galo leucino užtrauktukas, veikiantis kaip GTPazė (LZ). ).Domeno efektorinis domenas25,43.MX1 prisijungia prie virusinių polimerazių subvienetų, kad blokuotų viruso geno transkripciją43.Anksčiau praneštas mielių dviejų hibridų ekranas parodė, kad su PIAS1 susijęs MX1 slopina STAT1 sukeltą geno aktyvavimą, blokuodamas DNR surišimo aktyvumą, taip pat turi SUMO E344, 45 ligazės aktyvumą.Čia parodome, kad MX1 jungiasi su STAT1 (4C, D pav.), Tačiau kaip ši sąveika veikia STAT1 tarpininkaujamą geno aktyvavimą reaguojant į IFNα, reikia toliau tirti.Be to, mes taip pat nustatėme, kad MX1 sąveikavo su IFIT3 ir DDX60 visuose trijuose IFNα apdorotuose kartojimuose (S2C pav.).
DDX60 yra IFN sukelta citoplazminė helikazė, kuri anksčiau buvo pranešta, kad ji vaidina nuo RIG-I nepriklausomą virusinės RNR46 skaidymą.Jis sąveikauja su RIG-I ir aktyvuoja jo signalizaciją specifiniu ligandui 46. DDX60 susideda iš DEXD/H-Box helikazės domeno ir C-galo helikazės domeno, jungiančio viruso RNR ir DNR47.Dauguma jo sąveikos su MX1 ir IFIT3 įvyksta per ilgas N ir C-galų regionuose be kanoninių domenų ar motyvų (S2E pav., F).Tačiau MX1 taip pat yra susijęs su DEXD/H-Box helicase domenu (S2E pav.).IFIT šeimos baltymai turi išskirtinio spiralės posūkio-spiralės motyvo, vadinamo tetrapeptido kartojimu (TPR), tandemines kopijas.Nustatyta, kad IFIT3 yra teigiamas RIG-I signalizacijos moduliatorius, taigi ir MAVS komplekso komponentas.Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad IFIT3 ir DDX60 pirmiausia sąveikauja tarp IFIT3 TPR 3–6 ir gali turėti įtakos RIG-I/MAVS signalizacijai (S2F pav.).
Atsižvelgiant į tai, kad viso proteomo tikrinimas yra daug skaičiavimo reikalaujantis, tada patikrinome visą žmogaus UniProt duomenų bazę, ar nėra vieno iš IFNα apdorotų pakartojimų.Šioje kopijoje radome keletą labai patikimų sąveikos tinklų HLA-A.MS/MS spektrais nustatytų baltymų kelių analizė parodė, kad MHC-I pagrindu sukurtas antigeno apdorojimas ir pateikimas yra pagrindinis interferono sukeltas kelias (3D pav.).Todėl mes sutelkėme dėmesį į MHC-I molekulių baltymų sąveikos tyrimą su dideliu pasitikėjimu visuose susietuose mėginiuose.HLA susideda iš α1, α2 ir α3 domenų ir lengvųjų grandinių, o mikroglobulinas β2 (β2m) yra pastovus chaperono baltymas49.Surinkus endoplazminiame tinkle, HLA yra nestabili, jei nėra peptidinių ligandų50.Peptidų surišimo griovelį sudaro labai polimorfiniai ir nestruktūruoti α1 ir α2 domenai ne peptidinėje formoje ir santykinai mažiau polimorfinis α351 domenas.Esant IFNα, aptikome du HLA-A kompleksus: vienas sąveikauja su HMGA1 ir H2B (5 pav., S3 lentelė), o kitas sąveikauja su MDN1, LRCH4 ir H2B (6 pav.).
IFNα sukelia HLA-A sąveikos tinklą su H2B (H2BFS) ir HMGA1.(A) 2D brėžinys (sugeneruotas SIM-XL programinėje įrangoje), vaizduojantis skirtingų tipų sąveikas H2B-HLA-A-HMGA1 komplekse: tarpusavio ryšys (mėlynas), tarpusavio ryšys (raudonas) ir vienas ryšys (juodas)..Skirtingų tapatybių domenai žymimi spalvomis32: H2B (histonas; 2–102) ir MHC-I (MHC_1; 25–203, grupė C1; 210–290 ir MHC_I_C; 337–364).Kryžminio ryšio slenkstis buvo nustatytas 3,5.Taškinės diagramos rodo HLA-A sąveikos vietas su H2B (B) ir HMGA1 (C), taip pat K arba S sąveikos vietas tarp dviejų peptidų.Paveiksle kryžminio ryšio balo slenkstis nustatytas į 3,0.(D) Ryšiai tarp baltymų, parodytų PyMOL programos H2B, HLA-A ir HMGA1 baltymų struktūrose.Šios struktūros buvo modeliuojamos naudojant Phyre2 serverį (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), o H2B, HLA-A ir HMGA1 baltymų šablonų struktūros buvo atitinkamai 1kx552, 1kj349 ir ​​2eze55.
IFNα sukelia HLA-A sąveikos tinklą su H2B (H2BFS), MDN1 ir LRCH4.(A) Intramolekuliniai (raudoni) ir tarpmolekuliniai (mėlyni) kryžminiai ryšiai, pateikti 2D interaktyviame žemėlapyje (sugeneruotame SIM-XL programinėje įrangoje), o MDN1 pavaizduotas kaip apskritimas.Kryžminio ryšio slenkstis buvo nustatytas 3,5.Skirtingų tapatybių domenai koduojami spalvomis32: H2B (histonas; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 grupė; 210–290 ir MHC_I_C; 337–364) ir LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) ir Ch (535–641)).(B) Ryšiai tarp baltymų, parodytų PyMOL programos H2B, HLA-A, LRCH4 ir MDN1 baltymų struktūrose.Šios struktūros buvo modeliuojamos naudojant Phyre2 serverį (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) su šabloninėmis struktūromis 1kx552, 1kj349, 6hlu62 ir 6i2665 H2B, HLA-A, LRCH4 ir MDN1 baltymams, atitinkamai.Taškiniai grafikai, rodantys K arba S sąveikos vietas HLA-A su H2B (C), LRCH4 (D) ir MDN1 (E).Sklypų kryžminio ryšio balo slenkstis buvo nustatytas į 3,0.
Histonas H2B ne tik palaiko genomo vientisumą, bet ir dalyvauja transkripcijos reguliavime.H2B baltymą sudaro centrinis histono domenas (HFD), sudarytas iš trijų α-spiralių, atskirtų kilpomis, ir C-galinės uodegos 41, 52.Dauguma sąveikos su H2B vyksta α1 spirale, kuri užtikrina trimerizaciją su HFD heterodimeru (5A, B pav.).Nors lizinai dalyvauja surišant DNR, kai kurie lizinai taip pat yra alternatyvios acetilinimo arba metilinimo vietos.Pavyzdžiui, H2B liekanos K43, K46 ir K57 nedalyvauja tiesioginiame DNR surišime, bet yra įvairių potranskripcijos modifikacijų taikiniai53.Panašiai, likučiai K44, K47 ir K57 H2B gali atlikti alternatyvų vaidmenį esant IFNα, įskaitant sąveiką su kitais baltymais (5A, B pav.).Be to, ekstrachromosominis histonas H2B suaktyvina imuninį atsaką įvairių tipų ląstelėse, veikdamas kaip citozolinis jutiklis, aptinkantis dvigrandines DNR (dsDNR) fragmentus, gautus iš infekcinių agentų arba pažeistų ląstelių54.Esant DNR virusams, H2B išeikvojimas slopino IFN-β gamybą ir STAT154 fosforilinimą.Taip pat žinoma, kad H2B juda į branduolį ir iš jo greičiau nei kiti šerdies histonai54.H2B sąveika su MDN1 ir LRCH4 taip pat buvo pastebėta pasirinktuose neapdorotuose mėginiuose.Mes nustatėme, kad HLA-A sąveikavo su H2B visuose trijuose IFNα apdorotuose mėginiuose ir viename neapdorotame pakartotiniame mėginyje.Šie duomenys atspindi H2B vaidmenį alternatyvioje fiziologinėje funkcijoje, nepriklausomoje nuo transkripcijos reguliavimo.
HMGA1 (didelio mobilumo grupė AT-Hook 1), mažas nukleoproteinas, kuriame gausu ligas skatinančių aminorūgščių, buvo nustatytas kartu su HLA-A.Jis turi rūgštinę C-galo uodegą ir tris skirtingus DBD, vadinamus AT kabliukais, nes jie jungiasi prie dsDNR55, 56 AT turtingo regiono nedidelio griovelio.Šis surišimas priverčia DNR sulenkti arba ištiesinti, todėl kanoniniai transkripcijos faktoriai gali pasiekti konsensuso seką.Manoma, kad C-galo uodega yra susijusi su baltymų ir baltymų sąveika ir transkripcijos faktorių įdarbinimu, nes C-galo delecijos mutantai negali inicijuoti transkripcijos57.Be to, šiame domene yra keletas konservuotų fosforilinimo vietų, kurios yra žinomos kinazių substratai58.Mes stebėjome HLA-A ir H2B sąveiką su HMGA1 už C-galo domeno ribų, o tai rodo, kad C-galo domenas daugiausia naudojamas transkripcijos faktoriaus surišimui (5A, C pav.).HMGA baltymai konkuruoja su histonu H1 dėl prisijungimo prie adapterio DNR, taip padidindami prieinamumą57.Panašiai atrodo, kad HMGA sąveikauja su histonu H2B išilgai jungties DNR, konkuruodama su histonu H1.HMGB1 sukelia HLA-A, -B ir -C ekspresiją dendritinėse ląstelėse, todėl jos suaktyvėja59, tačiau anksčiau nebuvo pranešta apie HMG ir HLA sąveiką.Mes nustatėme, kad HMGA1 sąveikauja su HLA-A α1 ir α3 domenais, o dauguma sąveikų yra už jo 3 DBD ribų (5A, C pav.).Mūsų rankose buvo nustatyta, kad HLA-A yra lokalizuota branduolyje (duomenys nerodomi), ir atsižvelgiant į tai, kad H2B ir HMGA1 taip pat yra branduolyje, ši sąveika greičiausiai įvyksta branduolyje.Konkretūs adduktai, išmatuoti tarp H2B, HLA-A ir HMGA1, parodyti 5D paveiksle.
Dauguma HLA-A sąveikų su kitais baltymais vyksta jo α1 ir α2 domenuose ir netvarkingame C-galo domene (6 pav.).Viename iš šių pavyzdžių nustatėme, kad HLA-A sąveikauja su netvarkinga LRCH4 N-galine uodega (6A, D pav.).LRCH4 reguliuoja TLR4 aktyvaciją ir LPS citokinų indukciją, taip moduliuodamas įgimtą imuninį atsaką60, 61.Tai membraninis baltymas, turintis devynis daug leucino pasikartojimus (LRR) ir kalmodulino (CH) homologinį motyvą savo ektodomene, po kurio seka transmembraninis domenas (TMD)60, 62.Buvo pranešta, kad CH domenai tarpininkauja baltymų ir baltymų sąveikai60.Maždaug 300 aminorūgščių ruožas tarp LRR ir CH domenų yra gana prieinamas, bet netvarkingas.Remiantis netvarkingų regionų, kaip baltymų-baltymų tinklų ir vezikulinio transportavimo tarpininkų, funkcija 63, mes nustatėme, kad dauguma baltymų sąveikos vyksta netvarkinguose regionuose.Sąveika su MDN1 buvo paskirstyta per visą baltymo ilgį, įskaitant LRR1, LRR6, CH domenus ir atsitiktinius regionus, o H2B daugiausia prisijungė prie CH domeno (6A, B pav.).Pažymėtina, kad nė viena sąveika neapėmė TMJ, o tai rodo CLMS metodo specifiškumą (6A, B pav.).
MDN1 taip pat buvo nustatytas kaip HLA-A baltymų tinklo dalis (6A pav.).Jis priklauso AAA baltymų šeimai (ATPazės, susijusios su skirtinga veikla).Tai yra tas pats N-galo AAA domenas, kuris organizuojamas į heksamerinį žiedą ir pašalina surinkimo faktorių iš 60S 64 ribosomų subvieneto.Atrodo, kad panašus į Dynein64,65,66.Be to, po Asp/Glu turtingo regiono seka MIDAS domenas (nuo metalo jonų priklausoma vieta).Dėl didelio MDN1 dydžio (apie 5600 aminorūgščių) ir ribotos homologijos su gerai ištirtais baltymais, mažai žinoma apie jo struktūrą ir funkcijas žmonėms.Mes nustatėme HLA-A, H2B ir LRCH4 kaip MDN1 surišimo partnerius ir atskleidėme jų orientaciją kaip baltymų kompleksus PyMol (6A, B pav.).Šie trys baltymai sąveikauja su AAA domenu, dyneino tipo linkerio domenu ir galbūt MIDAS MDN1 domenu.Ankstesnėje ataskaitoje masalo baltymų afinitetas identifikavo MDN1 kaip baltymą, susijusį su histonu H2B67.Be to, neseniai atliktas tyrimas taip pat pranešė apie MDN ir HLA-B sąveiką HCT116 ląstelėse, naudojant afinitetu išgrynintą masės spektrometriją, patvirtinančią mūsų išvadas68.Šio komplekso identifikavimas IFNα apdorotuose mėginiuose rodo MDN1 vaidmenį interferono signalizacijoje.
Kadangi HLA genai yra labai polimorfiški, iš Flo-1 ląstelių RNR sekos duomenų išskyrėme sekos rodmenis, vaizduojančius HLA-A, -B ir -C (duomenys nerodomi).Peptidų sekos, atitinkančios sekos rodmenis, atskleidė reikšmingus skirtumus tarp HLA-A, -B ir -C regionuose, kuriuose HLA-A buvo kryžminiai peptidai (S3 pav.).Be to, mes nepastebėjome HLA-B / C molekulių kryžminio susiejimo tarp baltymų ir baltymų su H2B / HMGA1 / MDN1 / LRCH4 baltymais.Tai rodo, kad baltymų sąveika tarp HLA-A, MDN1, LRCH1 ir HMGA1 yra specifinė HLA-A.Be to, proteominė nesusietų mėginių analizė (S4 lentelė) parodė, kad HLA-A sekos aprėptis yra didesnė, palyginti su HLA-B arba HLA-C.HLA-A nustatyti peptidai buvo labai intensyvūs tiek IFNα apdorotuose, tiek neapdorotuose mėginiuose.
Siekdami užtikrinti, kad čia nustatytos sąveikos neatsirastų dėl nespecifinio dviejų baltymų kryžminio susiejimo arti erdvinės erdvės, mes dar patvirtinome du naujus HLA-A sąveikaujančius veiksnius, atlikdami bendro imunoprecipitacijos tyrimus.ŽLA-A sąveika su endogeniniu MDN1 ir H2B buvo aptikta tiek IFNα apdorotose, tiek neapdorotose Flo-1 ląstelėse (7 pav., S4 pav.).Patvirtinome, kad HLA-A užfiksavo H2B imunoprecipitate ir kad šis ryšys atsirado dėl gydymo IFNα, nes neapdorotų ląstelių imunoprecipitate mėginiuose HLA-A nebuvo (7A pav.).Tačiau mūsų duomenys rodo, kad IFNα skirtingai reguliuoja HLA-A prisijungimą prie H2B ir MDN1.IFNα sukelia ryšį tarp H2B ir HLA-A, bet sumažina jo ryšį su MDN1.Mes nustatėme, kad MDN1 buvo susijęs su HLA-A kontrolinėse grupėse, o IFNα pridėjimas sumažino šią sąveiką nepriklausomai nuo IFNα sukeltos MDN1 indukcijos (7B, C pav.).Be to, HLA-A imunoprecipitacija užfiksavo H2B A549 ląstelėse (S4 pav.), o tai rodo, kad ši sąveika nepriklauso nuo ląstelių tipo.Kartu šie rezultatai patvirtina interferono sukeltą HLA-A sąveiką su H2B ir MDN1.
HLA-A kartu valo H2B ir MDN1.Reprezentatyvūs endogeniniai H2B (A) ir MDN1 (B) imunoblotai buvo imunoprecipituoti iš IFNα apdorotų Flo-1 ląstelių ir ištirti, ar nėra nurodytų antikūnų.Pelės ir triušio IgG buvo naudojami kaip neigiama kontrolė.(C) Santykiniai skirtingų antigenų kiekiai (įvestis) pavaizduoti imunoblotais, tirtais prieš nurodytus antikūnus, β-aktinas buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė.
Buvo ištirtos vieno iš interferono sukeltų labai patikimų kryžminių tinklų H2B-HLA-A-HMGA1 struktūrinės savybės.Mes naudojome molekulinės dinamikos modeliavimą kaip alternatyvų metodą, kad suprastume šiame komplekse dalyvaujančių baltymų konformacinę dinamiką (8 pav.).CLMS duomenų išvados rodo, kad H2B, HLA-A ir HMGA1 baltymai gali turėti skirtingas konformacijas.Todėl tirpiklio terpėje buvo modeliuojami šie galimi kompleksai: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A ir H2B-HLA-A-HMGA1.Pradinis baltymų ir baltymų prijungimo ekranas, naudojant MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Monrealis, Kvebekas, Kanada) paketą, parodė galimas konformacijas, kurios skiriasi tarp šių baltymų (8A pav.).Sujungimo baltymų komplekso vizualizacija atskleidė keletą sąveikų ir galimų konformacijų (5A, 8 pav.).Taigi viena galima konformacija parodyta 8A paveiksle (su pažymėtomis kryžminėmis nuorodomis) ir toliau buvo įvertinta naudojant MD modeliavimo vamzdyną.Be to, H2B arba HMGA1 prisijungimas prie HLA-A išryškina didesnį H2B afinitetą HLA-A (8A pav.).
Galimų tinklų tarp H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A ir H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksų konformacinė dinamika.(A) Kairysis skydelis yra 2D žemėlapis (sugeneruotas SIM-XL programinėje įrangoje) iš intramolekulinių (raudonų) ir tarpmolekulinių (mėlynų) kryžminių ryšių (kryžminio ryšio riba nustatyta į 3,5).Be to, nustatytos kryžminio ryšio liekanos yra paženklintos ant H2B, HLA-A ir HMGA1 baltymų struktūrų.Susijusios šių baltymų konformacijos buvo išgaunamos naudojant prijungimo vamzdyną, įdiegtą MOE pakete.Apatiniame kairiajame skydelyje rodomos įvairios galimos H2B-HLA-A ir HMGA1-HLA-A kompleksų konformacijos su skirtingais baltymų ir baltymų surišimo afinitetais (GBVI / WSA dG; kcal / mol).(B) Kiekvienos baltymo struktūros atominių padėčių (išskyrus vandenilio atomus) standartinis nuokrypis (RMSD).(C) tarpmolekulinės baltymų ir baltymų vandenilio jungties sąveikos iš įvairių modeliuojamų kompleksų, atsižvelgiant į specifines sąveikas, kurių trukmė ≥ 10 ns.H-jungties donoro-akceptoriaus ribinis atstumas buvo nustatytas į 3,5 Å, o donoro-H-akceptoriaus ribinis kampas nustatytas į ≥ 160°–180°.(D) Pažymėtos liekanos, sudarančios HLA-A baltymo ir baltymo sąveiką su atitinkamais partneriais, apimančios ≥ 20 ns, ekstrahuotos iš netikrų HLA-A-H2B ir HLA-A-HMGA1 kompleksų.Baltymų struktūros atitinka vidutinę 100 ns MDS struktūrą.(E) Sąveika tarp HLA-A-H2B ir HLA-A-HMGA1 kompleksų, palyginti su sąveika, stebima H2B-HLA modeliavimu per 100 ns, remiantis K arba S sąveikos vieta tarp dviejų peptidų.Kompleksai /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Kryžminių ryšių vertinimo slenkstis buvo nustatytas kaip 3,0 ir buvo atsižvelgta į specifines MDS sąveikas, kurių trukmė ≥ 10 ns.Baltymų struktūros buvo vizualizuotos naudojant BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, JAV) ir Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Monrealis, Kvebekas, Kanada) paketus.
HLA-A molekulių stabilumas laikui bėgant (standartinis nuokrypis; RMSD arba standartinis nuokrypis; RMSF) parodė, kad H2B arba HMGA1 baltymų buvimas kompleksuose stabilizavo HLA-A (8B pav., S5 pav.).HMGA1 baltymas glaudžiai jungiasi prie HLA-A B2M vietos, sukeldamas HLA-A aminorūgščių stabilumą HLA-A-HMGA1 arba H2B-HLA-A-HMGA1 komplekse (8B pav., S5 pav.).konkrečiai, buvo nustatyta, kad HLA liekanos ~60-90 ir ~180-210 yra mažiau lanksčios esant H2B (8B pav.).H2B ir HMGA1 geriau jungėsi su HLA-A H2B-HLA-A-HMGA1 komplekse, palyginti su HLA-A prisijungimu prie H2B arba HMGA1 vien (8C, D paveikslai; S5 lentelė).Likučiai, susiję su vandeniliniu ryšiu (MD modeliuojamas didelis užimtumas ≥ 10 ns), sutampa su CLMS sąveikos vietomis (K arba S likučiais) komplekse, o tai rodo, kad CLMS nustatytos sąveikos yra labai patikimos.Patikimumas (8E pav.).Atliekant CLMS ir MD modeliavimą, nustatyta, kad HLA-A liekanos tarp maždaug 190-210 ir maždaug 200-220 aminorūgščių jungiasi atitinkamai su H2B ir HMGA1 (8E pav.).
Baltymų ir baltymų sąveika sudaro dinamiškus struktūrinius tinklus, kurie tarpininkauja tarpląsteliniam ryšiui reaguojant į tam tikrus dirgiklius.Kadangi daugelis proteomikos metodų nustato bendro baltymo pusiausvyros būsenos lygio pokyčius, baltymų ir baltymų sąveikos dinamikai reikia papildomų įrankių, kad būtų užfiksuotos surišimo sąsajos, o CLMS yra viena iš tokių priemonių.Interferono signalizacijos sistema yra citokinų tinklas, leidžiantis ląstelėms reaguoti į įvairius aplinkos patogeninius ir būdingus patologinius signalus, o tai baigiasi interferono indukuojamų baltymų pogrupių indukcija.Taikėme CLMS, kad nustatytume, ar galima nustatyti naujas baltymų ir baltymų sąveikas tarp interferono sukeltų baltymų grupės.Baltymų kompleksams užfiksuoti buvo naudojama pasaulinė baltymų kryžminio susiejimo analizė interferonu reaguojančiame Flo-1 ląstelių modelyje.Triptinių peptidų ekstrahavimas iš nesusietų ir susietų ląstelių leidžia skaičiuoti peptidus, praturtinti kelią ir paskirstyti peptido ilgį su nustatytu LFQ intensyvumu.Kanoniniai interferonu indukuojami baltymai buvo nustatyti kaip teigiama vidinė kontrolė, o buvo pastebėti nauji tarpmolekuliniai ir intramolekuliniai kryžminiai kanoninių interferonu indukuojamų baltymų, tokių kaip MX1, UP18, OAS3 ir STAT1, aduktai.Ištirtos įvairios struktūrinės ypatybės ir sąveikos funkcinėse srityse.
Sąveika tarp HLA-A, MDN1 ir H2B buvo aptikta imunoblotuojant Flo-1 ir A549 ląstelėse, apdorotose ir neapdorotose IFNα.Mūsų rezultatai rodo, kad HLA-A kompleksuoja su H2B priklausomai nuo IFNα.Mūsų darbas yra įdomus būdas toliau tirti šių dviejų kompleksų lokalizaciją.Taip pat būtų įdomu išplėsti CLMS požiūrį į ląstelių linijų grupę, kad būtų galima nustatyti nuo ląstelių tipo nepriklausomą interferono sukeltą baltymų sąveiką.Galiausiai, mes panaudojome MD modeliavimą kaip alternatyvų metodą, kad suprastume baltymų, dalyvaujančių H2BFS-HLA-A-HMGA1 komplekse, kuris stebėjo intramolekulinius ir tarpmolekulinius kryžminius pokalbius, konformacinę dinamiką.Iš CLMS duomenų padarytos išvados rodo, kad H2BFS, HLA-A ir HMGA1 baltymai gali turėti skirtingas konformacijas.Galimos skirtingos konformacijos tarp šių prijungimo baltymų kompleksų atskleidė keletą sąveikų, panašių į tas, kurios buvo stebimos CLMS duomenų rinkinyje.Vienas iš pagrindinių mūsų metodo privalumų yra tai, kad jis leidžia lengvai identifikuoti sąveikaujančius labai polimorfinius genus, tokius kaip HLA, todėl bus įdomu ištirti HLA haplotipui būdingų baltymų, kuriuos kitaip sunku ištirti, sąveiką.Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad CLMS gali būti naudojamas siekiant išplėsti mūsų supratimą apie interferono sukeltus signalizacijos tinklus ir suteikti pagrindą tirti sudėtingesnes tarpląstelines sistemas naviko mikroaplinkoje.
Flo-1 ląstelės buvo gautos iš ATCC ir laikomos DMEM (Gibco), papildytu 1% penicilino / streptomicino (Invitrogen), 10% galvijų vaisiaus serumo (Gibco) ir laikomos 37 ° C temperatūroje ir 5% CO2.Inkubavimas.Ląstelės buvo auginamos iki 70–80% susiliejimo, prieš jas apdorojant IFNα14 (pagaminta Edinburgh Protein Production Facility).Visos kitos cheminės medžiagos ir reagentai buvo įsigyti iš Sigma Aldrich, jei nenurodyta kitaip.
Flo-1 ląstelės buvo kultivuojamos 6 šulinėlių plokštelėse ir kitą dieną ląstelės buvo apdorotos 10 ng/ml IFNα14 24 valandas iki maždaug 80% susiliejimo.Ląstelės tris kartus plaunamos PBS ir perrišamos su šviežiai paruoštu DSS (Thermo Fisher Scientific) (tirpintu DMSO) PBS 5 minutes 37 °C temperatūroje iki galutinės koncentracijos 0,5 mM.DSS kryžminimo reakcija buvo pakeista PBS, o likęs DSS buvo užgesintas pridedant 20 mM Tris (pH 8, 0) PBS 15 minučių 37 ° C temperatūroje.Ląstelės buvo surinktos grandymo būdu ir surenkamos į mažai rišančius mėgintuvėlius (Axygen).
Ląstelių nuosėdos buvo lizuojamos 300 µl karbamido lizės buferio (8 M karbamidas, 0, 1 M Tris, pH 8, 5) 30 minučių kambario temperatūroje, retkarčiais purtant.Visi centrifugavimo etapai buvo atlikti 14 000 xg 8 ° C temperatūroje.Centrifuguokite lizatą 10 minučių ir perpilkite supernatantą į naują mėgintuvėlį.Likusios skaidrios dalelės buvo ištirpintos 150 μl antrojo lizės buferio (2 M karbamidas, 2% (m/v) SDS (natrio dodecilo sulfatas)) 30 minučių ar ilgiau, kol gaunamas vienalytis vandeninis tirpalas.Lizatas buvo centrifuguojamas 20 minučių, o supernatantas buvo sumaišytas su lizatu, gautu ankstesniame etape.Baltymų koncentracija buvo įvertinta naudojant Micro BCA testą (Thermo Fisher Scientific) pagal gamintojo nurodymus dėl mikroplokštelių procedūrų.Mėginiai buvo greitai užšaldomi skystame azote ir laikomi -80 °C temperatūroje.
Maždaug 100 μg tirpaus kryžminio ryšio baltymo buvo apdorota naudojant modifikuotą filtravimo mėginio paruošimo protokolą (FASP), kaip aprašyta Wisniewski ir kt.69 Trumpai tariant, baltymas kryžminamas su 200 µl karbamido buferio (8 M karbamidas 0,1 M Tris, pH 8,5), sumaišomas ir padalijamas per pusę.Visi centrifugavimo etapai buvo atlikti 14 000 xg 25 ° C temperatūroje.Pirmoji kryžminio ryšio baltymų lizato pusė buvo perkelta į 10 kDa Microcon centrifuginį filtro įrenginį su Ultracel-10 membrana (Merck), po to centrifuguojama ant filtro 25 minutes.Tada į filtrą įpilkite antrąją baltymo pusę ir pakartokite tuos pačius veiksmus.Baltymų atgavimas buvo atliktas pridedant 100 μl 17 mM tris (2-karboksietil) fosfino hidrochlorido (TCEP) į karbamido buferį.Rekuperacija buvo maišoma termomikseryje 600 aps./min. greičiu 30 min. 37 °C temperatūroje.Peptidų atsigavimas buvo pagerintas į filtrą įpylus 50 μl 0,5 M NaCl, po to centrifuguojant 25 minutes.
C18 Micro Spin kolonėlės (Harvard Apparatus) buvo naudojamos kryžminių tripsinių peptidų druskų šalinimui pagal Bouchal et al.70 aprašytą protokolą su nedideliais pakeitimais.Trumpai tariant, C18 sukimosi kolonėlės buvo aktyvuotos tris kartus plaunant 0,1% skruzdžių rūgšties (FA) acetonitrile (AcN) (Merck) ir du kartus plaunant 0,1% FA.Kolonėlė buvo hidratuota 0,1% FA 15 minučių.Išsūdyti peptidai buvo nuosekliai eliuuojami laipsnišku gradientu, naudojant 50%, 80% ir 100% AcN 0,1% FA.Mėginiai buvo džiovinami SpeedVac Plus koncentratoriuje (Eppendorf), kol likęs skystis visiškai išnyko.Eliuuoti peptidai buvo ištirpinti 100 μl 0,08% trifluoracto rūgšties 2,5% AcN ir koncentracijos buvo išmatuotos NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Į LC-MS/MS sistemą buvo įšvirkšta maždaug 1 μg susieto peptido kiekvienam mėginiui.
Kryžminiai peptidai buvo atskirti naudojant UltiMate 3000 RSLCnano LC sistemą (Thermo Scientific), prijungtą prie Orbitrap Exploris 480 masės spektrometro (Thermo Scientific).Kryžminiai peptidai buvo surinkti ant 300 µm ID, 5 mm ilgio µ-prieškoloninės C18 gaudymo kolonėlės, užpildytos C18 PepMap100 sorbentu ir 5 µm PepMap sorbentu (Thermo Scientific).Į siurblio srautą įdėkite 5 µl/min 0,08 % trifluoracto rūgšties, ištirpintos 2,5 % AcN.Kryžminiai peptidai buvo atskirti ant analitinio lydyto silicio dioksido kolonėlės, kurios vidinis skersmuo 75 μm ir ilgis 150 mm, užpildyta 2 μm PepMap sorbentu (Thermo Scientific).Judančios fazės A ir B sudarė atitinkamai 0,1 % FA vandenyje ir 0,1 % FA acetonitrile.Gradientas prasideda nuo 2,5% B ir tiesiškai didėja iki 40% B per 90 minučių, tada iki 90% B per kitas 2 minutes.Mobiliosios fazės sudėtis buvo palaikoma 90% B 10 minučių, o po to per 2 minutes tiesiškai sumažėjo iki 2, 5% B.Kolonėlė buvo subalansuota esant 2,5% B 8 minutes prieš kitą ciklą.Iš analitinės kolonėlės išplauti kryžminiai peptidai buvo jonizuoti nanoelektrospray jonizacijos (NSI) šaltinyje ir įšvirkšti į Exploris 480 masės spektrometrą (Thermo Scientific).
Orbitrap Exploris 480 masės spektrometras veikė teigiamo duomenų koreliacijos režimu.Visas nuskaitymas buvo atliktas sekcijos režimu 120 000 skiriamąja geba su diapazono nustatymais nuo m/z 350 Th iki m/z 2000 Th.Normalizuotas AGC tikslas buvo nustatytas 300%, o didžiausia įvesties laikas yra 50 ms.Buvo nustatytas peptidų monoizotopų smailių aptikimas.Apribojimų atsipalaidavimo parametras nustatomas kaip tiesa, jei randama per mažai pirmtakų.Minimalus pirmtako joninis stiprumas buvo nustatytas į 5, 0e3, o pirmtakų įkrovos būsenos buvo įtrauktos į eksperimentus iki +8.
Ciklo laikas tarp pagrindinių nuskaitymų duomenų koreliacijos režimu buvo nustatytas į 2,5 sekundės.Dinaminis masės išskyrimas buvo nustatytas 20 s po pirmojo pirmtako jono suskaidymo.Pirmtakų izoliacijos langas buvo nustatytas 2 -ąja.Normalizuotas susidūrimo energijos tipas su fiksuotu susidūrimo energijos režimu buvo pasirinktas atliekant nuo duomenų priklausomą MS/MS nuskaitymą.Susidūrimo energija yra 30%.Orbitrap skiriamoji geba buvo nustatyta iki 15 000, o AGC tikslas - 100%.Pasirinktinis maksimalus įpurškimo laikas yra 60 milisekundžių.
Prieš sekdami baltymų ir baltymų tinklą kryžminiuose mėginiuose, apdorojome neapdorotus failus naudodami MaxQuant paketą (1.6.12.0 versija)26,27, kad mėginiuose identifikuotume atsekamus peptidus / baltymus.Be to, panašios proteominės analizės buvo atliktos su nesujungtais Flo-1 mėginiais, apdorotais ir neapdorotais IFNα.MS/MS duomenų buvo ieškoma UniProt žmonių duomenų bazėje (www.uniprot.org) (įkelta 2020 m. rugpjūčio 12 d., yra 75 093 įrašai), naudojant įmontuotą paieškos programą Andromeda27.Paieška atlikta nenurodant fermento specifiškumo ir įvairių deamidacijos (N, Q) ir oksidacijos (M) modifikacijų.Pirmtakų masės tolerancijos buvo nustatytos 20 ppm, o produkto jonų - 0, 02 Da.Pradinis ir didžiausias masės nuokrypis buvo 10 ppm.Didžiausia peptido masė buvo nustatyta ties 4600 Da, o sekos panašumas nustatytas tarp 7 ir 25 aminorūgščių (aa).Tolesnė statistinė analizė atlikta naudojant Perseus programą (1.6.10.45 versija).Baltymų kiekis buvo apskaičiuotas normalizavus baltymo spektrinį intensyvumą (LFQ intensyvumas; nepažymėtas kiekybinis įvertinimas)27, o intensyvumo reikšmės buvo konvertuotos į Log2.Kelio praturtinimo analizė buvo atlikta naudojant Reactome kelio duomenų bazę, skirtą IFNα apdorotiems baltymams, kurie buvo aktyvuoti daugiau nei keturis kartus, palyginti su neapdorotais mėginiais.
Lizinui (K) arba serinui (S) specifinių cheminių baltymų kompleksų, stebimų LC-MS/MS, identifikavimas buvo atliktas naudojant spektroskopinį kryžminių peptidų (SIM-XL) identifikavimo įrenginį (SIM-XL)29.Pirma, galima sąveika tarp su interferonu susijusių (IFN) DNR atsparumo pažeidimams parašo (IRDS) genų buvo ištirta naudojant IRDS baltymų duomenų rinkinį, aprašytą Padariya ir kt.28.Visų žmogaus UniProt sąlygų ir pakartojimų patikrinimas reikalauja daug skaičiavimo, todėl visoje žmogaus UniProt duomenų bazėje (www.uniprot.org) (atsisiųsta 2020 m. rugpjūčio 12 d., yra 75 093 įrašai) prieš IFNα apdorotus pasikartojimus.Vienas iš aukšto pasitikėjimo sąveikos filtrų.Šios gautos didelės reikšmės sąveikos buvo išplėstos ir išbandytos visais pasikartojimais ir sąlygomis.
SIM-XL DSS buvo naudojamas kryžminiam jungikliui (XL), o XL svorio poslinkis ir modifikacijos svorio poslinkis buvo nustatyti atitinkamai į 138,06 ir 156,07.Nagrinėjamos šios kryžminio ryšio reakcijos vietos: KK, KS ir KN-TERM, be reporterių jonų.Tiek pirmtakų, tiek fragmentų ppm buvo nustatytas į 20, o Xrea slenkstis nustatytas į 0,15.Trypsinas buvo laikomas visiškai specifiniu, todėl buvo įdiegtas didelės energijos C-trap (HCD) suskaidymo metodas.XCorr dinaminio DB mažinimo slenkstis ir minimalus peptidų skaičius dinaminiam DB mažinimui buvo nustatytas atitinkamai 2,5 ir 2.Kiti parametrai yra: monoizotopų tikimybė ir didžiausio sutapimo riba, mažiausiai 4 AA likučiai vienoje grandinėje ir maksimalus pluošto krūvis bei 3 didžiausi praleistų skilimų.Gauti sujungti 2D žemėlapiai buvo analizuojami (SIM-XL), o xQuest28 grafinis vaizdas buvo naudojamas kuriant 2D žemėlapius.Baltymų kryžminiai ryšiai baltymų struktūrose pateikiami PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, 2.0 versija Schrödinger, LLC).
Baltymų modelių struktūros buvo sukurtos naudojant Phyre2 serverį (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11, naudojant homologijos modeliavimo ir „Paslėpto Markovo metodo“ diegimo principus.Baltymų struktūra buvo vizualizuota naudojant BIOVIA Discovery Studio Visualizer paketą (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, JAV) ir Molecular Operating Environment paketą (MOE; Chemical Computing Group Inc., Monrealis, Kvebekas, Kanada).