ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Dvipusis suvirintas vamzdis, skirtas chemijos pramonei, cheminis komponentas, SPECC1L trūkumas padidina sujungtų jungčių stabilumą ir sumažina kaukolės nervinių sluoksnių ląstelių išsiskyrimą.

Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com.Naudojate naršyklės versiją su ribotu CSS palaikymu.Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“).Be to, norėdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stilių ir JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 dvipusis suvirintas vamzdis chemijos pramonei

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.yra pirmaujantis gamintojas , kuris specializuojasi nerūdijančio plieno besiūlių vamzdžių , šviesiai atkaitintų vamzdžių , besiūlių suvyniotų vamzdžių ir kt .Siekdami palengvinti klientų poreikius, suvirinome ir vamzdžius.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.turi pažangiausią gamybos ir bandymo įrangą.Mes galime visiškai patenkinti jūsų reikalavimą.Pagal standartą labai griežtai, mūsų gaminami vamzdžiai visada turi teisingą OD ir WT toleranciją.Tolerancijos kontrolė griežtai atitinka gamybos standartus.Mūsų gaminiai visada patenkinti klientais.Klientai, pirkę mūsų gaminius, uždirbo daugiau pelno.
a) OD (išorinis skersmuo): nuo 3,18 mm iki 101,6 mm
b) WT (sienos storis): nuo 0,5 mm iki 20 mm
c) Ilgis: pagal kliento reikalavimus
d) Standartai: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ir kt
e) Proceso metodas: ERW, EFW ir kt

Slankikliai, rodantys tris straipsnius vienoje skaidrėje.Norėdami pereiti per skaidres, naudokite mygtukus „Atgal“ ir „Kitas“ arba, norėdami pereiti per kiekvieną skaidrę, naudokite skaidrių valdiklio mygtukus pabaigoje.
Kaukolės nervinės keteros ląstelės (CNCC) atsitraukia nuo embrioninių nervinių raukšlių ir migruoja į ryklės lankus, kurie sudaro daugumą vidurinio veido struktūrų.CNCC disfunkcija vaidina svarbų vaidmenį burnos veido plyšio, dažno įgimto apsigimimo, etiologijoje.Heterozigotinės SPECC1L mutacijos buvo nustatytos pacientams, sergantiems netipiniais ir sindrominiais įtrūkimais.Čia mes pranešame apie sustiprintą kanoninės lipniosios jungties (AJ) komponentų, β-katenino ir E-kadherino dažymą kultivuojamose SPECC1L numušimo ląstelėse, o elektroninės mikrografijos rodo AJ viršūninę-bazinę difuziją.Norėdami suprasti SPECC1L vaidmenį kaukolės ir veido morfogenezėje, sukūrėme Specc1l trūkumų turintį pelės modelį.Homozigotiniai mutantai yra mirtini embrionai, jiems sutrikęs nervinio vamzdelio uždarymas ir CNCC laminavimas.AJ baltymų dažymas padidėja mutantinėse nervinėse raukšlėse.Šis AJ defektas atitinka CNCC delaminacijos defektą, dėl kurio reikia ištirpinti AJ.Be to, Specc11 mutantai sumažino PI3K-AKT signalizaciją ir padidino apoptozę.In vitro, lengvo PI3K-AKT signalizacijos slopinimo laukinio tipo ląstelėse pakako, kad sukeltų AJ pokyčius.Svarbu tai, kad SPECC1L numušimo sukeltus AJ pokyčius galima pakeisti suaktyvinus PI3K-AKT kelią.Visi šie duomenys rodo, kad SPECC1L, kaip naujas PI3K-AKT signalizacijos ir AJ biologijos reguliatorius, reikalingas nervinio vamzdelio uždarymui ir CNCC stratifikacijai.
Kranialinės nervinės keteros ląstelės (CNCC) lokalizuojasi nugarinėje neuroektodermoje ir atsiskiria nuo besivystančių nervinių raukšlių neuroepitelio per procesą, apimantį epitelio-mezenchiminį perėjimą (EMT) 1, 2, 3.Premigruojantys epitelio CNCC sutrikdo tarpląstelines jungtis ir tampa migruojančiomis mezenchiminėmis CNCC, kurios užpildo pirmąjį ir antrąjį ryklės lankus ir sudaro didžiąją dalį kaukolės ir veido kremzlės.Taigi genai, reguliuojantys CNCC funkciją, dažnai sutrinka dėl kaukolės ir veido įgimtų anomalijų, tokių kaip burnos ir veido plyšiai, dažniausiai paveikiantys 1/800 gimdymų vien JAV.Viena iš įgimtų deformacijų8.
CNCC atsiskyrimas sutampa su priekinio nervinio vamzdelio uždarymu nuo 8,5 iki 9,5 pelių embriono vystymosi dienos.Daugelio pelių burnos ir veido plyšio genų mutantai taip pat turi tam tikros formos nervinio vamzdelio defektų, įskaitant Irf69, 10, Ghrl310, Cfl111 ir Pdgfrα12.Tačiau nervinio vamzdelio uždarymo ir CNCC stratifikacijos procesai gali būti laikomi nepriklausomais, nes Splotch mutantinė pelė (Pax3) turi nervinio vamzdelio uždarymo defektų, nedarant jokio poveikio CNCC stratifikacijai ar migracijai 13, 14.Papildomi pelių modeliai su CNCC išskyrimo ir nervinio vamzdelio uždarymo defektais padės apibūdinti bendrą šių dviejų procesų molekulinį pagrindą.
Norint išskirti CNCC iš neuroepitelinių ląstelių, reikia ištirpinti lipniąsias jungtis (AJ), kurias sudaro baltymų kompleksai, kuriuose, be kita ko, yra E-kadherinas, β-kateninas, α-E-kateninas ir α-aktininas, susijęs su aktino gijomis 2 Pernelyg didelės ekspresijos tyrimai E-kadherinas nervinėse raukšlėse parodė CNCC delaminacijos sumažėjimą arba vėlavimą.Priešingai, E-kadherino slopinimas sukelia ankstyvą stratifikaciją15, 16.Daugelis veiksnių, tarpininkaujančių EMT CNCC stratifikacijos metu, yra transkripcijos faktoriai (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) ir ekstraląstelinės matricos (ECM) remodeliavimo baltymai, tokie kaip matricos metaloproteinazės (MMP), tačiau CNCC yra tiesioginiai citoskeleto AJ reguliatoriai. dar nežinoma.Yra žinoma, kad PI3K-AKT kelias antagonizuoja E-kadherino kiekį, daugiausia dėl vėžio tyrimų17.Naujausi tyrimai parodė, kad PDGFα pagrindu veikiančio PI3K-AKT signalizacijos praradimas pelėms sukelia kaukolės ir veido anomalijas, įskaitant gomurio ir nervinio vamzdelio defektus12.Tačiau ryšys tarp PI3K-AKT kelio ir AJ stabilumo CNCC stratifikacijos metu yra neaiškus.
Anksčiau mes nustatėme, kad SPECC1L yra pirmasis mutantinis genas dviem žmonėms, turintiems sunkų plyšį, kuris tęsiasi nuo burnos iki akies, žinomą kaip įstrižas plyšys (ObFC) arba Tessier IV18 plyšys.SPECC1L mutacijos buvo nustatytos dviejose kelių kartų šeimose, sergančiose autosominiu dominuojančiu Opitz G/BBB sindromu (OMIM #145410), kai paveiktiems asmenims pasireiškė padidėjęs atstumas ir lūpos/gomurio skilimas19, ir vienoje šeimoje, sergančioje blauzdikaulio perstūmimo sindromu (OMIM #145420)20. .daugiau nei pusė Opitz G/BBB sindromo atvejų yra susieti su X (OMIM #300000) ir juos sukelia MID1 geno, koduojančio su mikrotubuliais susijusio ląstelės skeleto 22 baltymą, mutacijos.Manome, kad SPECC1L, taip pat baltymas, susijęs su mikrotubuliais ir aktino citoskeletu, gali tarpininkauti signalizacijai, reikalingai aktino citoskeleto remodeliavimui ląstelių adhezijos ir migracijos metu 18 .Atlikdami tyrimus in vitro ir in vivo, dabar aprašome SPECC1L kaip naują AJ stabilumo reguliatorių per PI3K-AKT signalizaciją.Ląstelių lygiu dėl SPECC1L trūkumo sumažėjo pan-AKT baltymo lygis ir padidėjo AJ viršūninė-bazinė dispersija, kuri buvo pašalinta cheminiu būdu suaktyvinus AKT kelią.In vivo embrionams, kuriems trūksta Specc11, yra sutrikęs nervinio vamzdelio uždarymas ir sumažėjęs CNCC skrodimas.Taigi, SPECC1L veikia labai reguliuojamuose ląstelių adhezijos pagrindu veikiančiuose signaluose, reikalinguose normaliai CNCC funkcijai veido morfogenezės metu.
Norėdami apibūdinti SPECC1L vaidmenį ląstelių lygiu, mes panaudojome anksčiau aprašytą stabilią osteosarkomos ląstelių liniją U2OS, kuriai trūksta SPECC1L18.Šiose stabiliose U2OS ląstelėse su SPECC1L (kd) numušimu SPECC1L transkriptų ir baltymų kiekis sumažėjo vidutiniškai (60–70 %), taip pat buvo migracijos ir aktino citoskeleto 18 reorganizacijos defektų. Priešingai, stiprus laikinas sumažėjimas Nustatyta, kad SPECC1L sukelia mitozinius defektus 23 .Toliau apibūdindami nustatėme, kad mūsų stabilios SPECC1L-kd ląstelės morfologiją pakeitė labai dideliu susiliejimo laipsniu (1 pav.).Atskiros kontrolinės ląstelės ir kd ląstelės, esant mažam susiliejimui, atrodė panašiai (1A, D pav.).Praėjus 24 valandoms po suliejimo, kontrolinės ląstelės išlaikė kuboidinę formą (1B pav., E), o SPECC1L-kd ląstelės pailgėjo (1C, F pav.).Šio ląstelės formos pokyčio mastas buvo užfiksuotas tiesioginiu kontrolinių ląstelių ir kd ląstelių vaizdavimu in vivo (1 filmas).Norėdami nustatyti SPECC1L vaidmenį susiliejančiose ląstelėse, pirmiausia ištyrėme jo ekspresiją.Mes nustatėme, kad suliejus SPECC1L baltymų kiekis padidėjo (1G pav.), o SPECC1L nuorašo lygis nepadidėjo (1H pav.).Be to, padidėjus ląstelių tankiui, SPECC1L baltymas kaupėsi tarpląstelinėse ribose (2 pav. A-E), o modelis sutampa su membrana susijusio β-katenino (2A pav. A'-E').Atsižvelgiant į SPECC1L ryšį su aktino citoskeletu 18, 23, iškėlėme hipotezę, kad SPECC1L sąveikauja su aktino pagrindu veikiančiomis lipniomis jungtimis (AJ).
(AF) SPECC1L numušimo (DF) ląstelės pailgėja esant dideliam susiliejimui (F), palyginti su kontrolinėmis U2OS ląstelėmis (AC).Čia parodyti trys iš šešių laiko taškų (T1, T3, T6), kuriuos pasirinkome skirtingiems ląstelių tankiams.(G) Western blot analizė, rodanti, kad SPECC1L baltymas yra stabilizuotas esant aukštam susiliejimo laipsniui, palyginti su mažu susiliejimo laipsniu kontrolinėse ląstelėse.SPECC1L Western blot rodo numatomą 120 kDa juostą ir didesnės molekulinės masės juostą, galbūt modifikuotą po transliacijos (*).Western blot analizė buvo atlikta tomis pačiomis sąlygomis mažam ir dideliam susiliejimui.Vaizdai, rodantys SPECC1L esant mažam ir dideliam susiliejimui, buvo paimti iš tos pačios dėmės.Ta pati dėmė buvo pašalinta ir iš naujo ištirta naudojant β-aktino antikūną.(H) Kiekybinė RT-PGR analizė neparodė reikšmingų SPECC1L transkripto lygių pokyčių.Klaidų juostos rodo SEM iš keturių nepriklausomų eksperimentų.
(AE) Mes pasirinkome šešis laiko taškus (T1-T6), vaizduojančius ląstelių tankio diapazoną, kad normalizuotume ląstelių formos analizę ir AJ pokyčius U2OS ląstelėse su SPECC1L numušimu (kd).Pirmieji penki iš šių laiko taškų apėmė pavienes ląsteles (T1), 50–70% mažų ląstelių grupių susiliejimą (T2), suliejimą neperformuojant kd ląstelių (T3), keičiant kd ląsteles (T4) ir 24 valandų pokyčius.užpakalinėje kd (T5) ląstelių formoje.SPECC1L baltymas daugiausia buvo išsklaidytas citoplazmoje T1 (A), tačiau jo kaupimasis buvo pastebėtas tarpląstelinėse ribose vėlesniais laiko taškais (B – E, rodyklės).(FJ) β-kateninas rodo panašų kaupimąsi tarpląstelinėse ribose, susijusiose su AJ kompleksu.(A'-E') SPECC1L ir β-kateninas rodo persidengiantį dažymą prie ląstelių sienų esant dideliam ląstelių tankiui (rodyklės).(F'-J') SPECC1L-kd ląstelėse β-katenino dažymas atrodo normalus esant mažam ląstelių tankiui (F'-H'), bet plečiasi keičiantis ląstelių formai (I', J'; rodyklės), o tai rodo, kad AJ pasikeitė.Strypai = 10 µm.
Tada bandėme nustatyti SPECC1L trūkumo poveikį AJ.Mes naudojome keletą su AJ susijusių žymenų, įskaitant kanoninius komponentus F-aktiną, mioziną IIb, β-kateniną ir E-kadheriną 24, 25, 26, 27.Aktino streso skaidulų padaugėjo SPECC1L-kd ląstelėse, kaip aprašyta anksčiau (3A, B pav.)18.Miozinas IIb, susijęs su aktino gijomis, parodė panašų SPECC1L-kd ląstelių padidėjimą in vitro (3C, D pav.).Su AJ susijęs β-kateninas jungiasi prie kadherino prie ląstelės membranos, rodydamas įprastą "korių" ekspresijos modelį kontroliniuose kubocituose (3E, G pav.).Įdomu tai, kad plokščiuose vaizduose, naudojant konfokalinę mikroskopiją, β-katenino (3E, F pav.) ir E-kadherino (3G pav., H) dažymas ant susiliejančių SPECC1L trūkumo ląstelių ląstelių membranos parodė ryškius išplėstinio dažymo modelius.Šis su AJ susijusio β-katenino dažymo išsiplėtimas kd ląstelėse buvo ryškiausias susiliejimo metu, tačiau atrodė, kad jis buvo prieš ląstelių formos pokyčius (2F-J pav., F'-J').Norėdami nustatyti šio išplėstinio AJ dažymo fizinį pobūdį, transmisijos elektronų mikroskopu (TEM) ištyrėme ląstelių sienas ant SPECC1L-kd U2OS ląstelių viršūninio-bazinio paviršiaus (3I, J pav.).Priešingai nei kontrolinės ląstelės (3I pav.), kuriose buvo atskiros elektronų tankio sritys, rodančios AJ (rodyklės), kd ląstelės (3J pav.) rodė dideles, gretimas sritis, kuriose didelis elektronų tankis rodo AJ išilgai apikobazinės plokštumos..Be to, ant skersinių pjūvių, mes pastebėjome plačias ląstelių membranų raukšles kd ląstelėse (S1A, B pav.), o tai paaiškina išplėstą β-katenino ir E-kadherino dažymo juostų modelį (3 pav. F, H).Siekiant paremti SPECC1L vaidmenį AJ, β-kateninas buvo kartu imunoprecipituotas su SPECC1L susiliejančių U2OS ląstelių lizatuose (3K pav.).Kartu su išplėstiniu AJ žymenų imuniniu dažymu, TEM analizė atitiko mūsų hipotezę, kad SPECC1L trūkumas padidina AJ viršūninio-bazinio tankį ir dispersiją.
(AH) Padidėjęs F-aktino dažymas kd ląstelėse praėjus 48 valandoms po suliejimo (T6; A, B).Pakeistas miozino IIb dažymas, susijęs su F-aktinu (C, D).Lygus β-katenino ir E-kadherino membranos dažymas kontrolinėse ląstelėse (E, G) buvo sustiprintas SPECC1L-kd (F, H) ląstelėse.Strypai = 10 µm.(I–J) Elektronų mikrografijos, stebinčios viršūninę-bazinę tarpląstelinę jungtį.Kontrolinės ląstelės rodo skirtingus elektronų tankius regionus, nurodančius lipnias jungtis (I, rodyklės).Priešingai, visa SPECC1L-kd ląstelių viršūninė-bazinė jungtis pasirodė tanki elektronų (J, rodyklės), o tai rodo padidėjusį lipnių jungčių tankį ir dispersiją.(K) β-kateninas buvo kartu imunoprecipituotas su SPECC1L susiliejusiuose U2OS ląstelių lizatuose.Vaizdas, paimtas iš vienos vietos, vaizduojantis vieną iš keturių nepriklausomų eksperimentų.
Norėdami suprasti SPECC1L vaidmenį kaukolės ir veido morfogenezėje, sukūrėme Specc1l deficito pelės modelį, naudodami dvi nepriklausomas ES gaudyklių ląstelių linijas DTM096 ir RRH048 (BayGenomics, CA), kurios atstovauja 1 introną, o Specc1l transkriptai buvo užfiksuoti 15 (1 pav.). .4A, S2 pav.).Apgaulės vektoriaus intarpo genominė vieta buvo nustatyta viso genomo sekos nustatymu ir patvirtinta PGR (S2 pav.).Abi genų spąstų konstrukcijos taip pat leido kadre sujungti Specc11-lacZ reporterius fiksuojant.Todėl lacZ ekspresija, nustatyta X-gal dažymu, buvo naudojama kaip Specc11 ekspresijos indikatorius.Abu aleliai parodė panašius lacZ ekspresijos modelius, o DTM096 geno spąstai 1 introne parodė stipresnę ekspresiją nei RRH048 15 introne (neparodyta).Tačiau Specc1l yra plačiai išreikštas, ypač stipriai išreikštas nervinių raukšlių ties E8.5 (4B pav.), nervinio vamzdelio ir veido procesuose ties E9.5 ir E10.5 (4C, D pav.) ir besivystančiose galūnėse. prie E10.5 ir akis (4D pav.).Anksčiau pranešėme, kad SPECC1L ekspresija pirmajame ryklės lanke ties E10.5 buvo epitelyje ir pagrindiniame mezenchime18, atitinkanti CNCC liniją.Norėdami patikrinti SPECC1L ekspresiją CNCC, atlikome E8.5 nervines raukšles (4E-J pav.) ir E9.5 kaukolės dalis (4K pav.).Esant E8.5, SPECC1L intensyviai dažė nervines raukšles (4E pav., H), įskaitant ląsteles, nudažytas NCC žymenimis (4G pav., J).Esant E9.5, SPECC1L (4K pav., N) stipriai nusidažė migruojantis CNCC kartu su AP2A (4L pav., M) arba SOX10 (4O pav., P).
(A) Pelės Specc11 geno schema, rodanti apgaulės vektoriaus įterpimą ES DTM096 (intronas 1) ir RRH048 (intronas 15) ląstelių klonuose.(BD) lacZ dažymas heterozigotinių Specc1lDTM096 embrionų, reprezentuojančių Specc1l ekspresiją nuo E8.5 iki E10.5.NE = neuroektoderma, NF = nervinė raukšlė, PA1 = pirmasis ryklės lankas.(EP) SPECC1L imuninis dažymas NCC žymenimis AP2A ir SOX10 E8.5 (NF; EJ) nervinėse raukšlėse ir E9.5 (KP) kaukolės skyriuose.SPECC1L dažymas buvo plačiai stebimas nervinėse raukšlėse E8.5 (E, H; rodyklių galvutės), įskaitant ląsteles, pažymėtas AP2A (F, G; rodyklių galvutės) ir SOX10 (I, J; rodyklių galvutės).Esant E9.5, SPECC1L stipriai nudažė migruojančius CNCC (K, N; rodyklės), pažymėtus AP2A (L, M; rodyklės) ir SOX10 (O, P; rodyklės).
Kryžminimas tarp heterozigotinių Specc1lDTM096/+ ir Specc1lRRH048/+ pelių rodo, kad du genų gaudyklės aleliai nėra vienas kitą papildantys ir kad bet kurio geno spąstų alelio junginiai heterozigotai ir embrioniniai homozigotai yra embrionui mirtini (S1 lentelė).Mendelio rodikliai rodė heterozigotų išgyvenamumo sumažėjimą gimus (numatomas 1,34 prieš 2,0).Pastebėjome mažą perinatalinį mirtingumą tarp heterozigotų, kai kurie turėjo kaukolės ir veido anomalijų (S3 pav.).Tačiau dėl mažo šių perinatalinių kaukolės ir veido fenotipų įsiskverbimo sunku ištirti pagrindinius patofiziologinius mechanizmus.Todėl mes sutelkėme dėmesį į homozigotinių Specc11 mutantų embrioninį mirtiną fenotipą.
Dauguma sudėtinių heterozigotinių arba homozigotinių Specc1lDTM096/RRH048 mutantų embrionų po E9.5–10.5 neišsivystė (5A–D pav.), o nervinis vamzdelis neužsidarė iš priekio (5B, D pav.), o kartais užsidarė užpakalyje (neparodyta). ..Šis kaukolės nervinio vamzdelio uždarymo defektas buvo susijęs su dauguma CNCC pažymėtų DLX2, likusių nervinėse raukšlėse ties E10.5, o tai rodo, kad nėra išskyrimo (5A'-D' pav.).Norėdami nustatyti, ar bendras CNCC dydis taip pat sumažėjo, mes pažymėjome CNCC linijas su GFP savo genų gaudyklės linijose su Wnt1-Cre ir ROSAmTmG.Mes srautu perduodame išrūšiuotus GFP+ NCC ir GFP- (RFP+) ne NCC iš ištisų embrionų.E9.5 metu srautu surūšiuotų GFP pažymėtų CNCC dalis reikšmingai nepasikeitė tarp WT ir mutantų embrionų (neparodyta), o tai rodo normalią CNCC specifikaciją.Todėl iškėlėme hipotezę, kad likutinis Wnt1-Cre ir DLX2 dažymas atvirose nervinėse raukšlėse (5B pav.) atsirado dėl netinkamo CNCC sluoksniavimo, galbūt dėl ​​​​padidėjusio AJ ląstelių tankio ar dispersijos, kaip matyti iš SPECC1L-kd ląstelėse.Naudojome NCC žymenis SOX10, AP2A ir DLX2, kad patvirtintume CNCC buvimą nervinėje raukšlėje (5E-R pav.).E8.5 metu WT (5E, G, I pav.) ir Specc1l mutanto (5F, H, J) sekcijose buvo pastebėtas visų trijų NCC žymenų nervinių klosčių dažymas.Tuo E9.5, o NCC žymenys nusidažė migruojančiais NCC WT sekcijose (5M pav., O, Q), likutinis NCC dažymas buvo pastebėtas Spec1l mutantų embrionų veikiamose nervinėse raukšlėse (5N, P, R pav.).Kadangi SOX10 ir DLX2 žymi migruojančius CNCC, šis rezultatas rodo, kad CNCC, kuriems trūksta SPECC1L, pasiekia specifikaciją po migracijos, bet negali migruoti iš nervinių raukšlių.
Dėl Specc11 trūkumo nervinio vamzdelio uždarymas yra netinkamas, kaukolės nervinio keteros ląstelių ir AJ atsiskyrimas.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrionas, turintis migruojančias kaukolės nervo keteros ląsteles (CNCC), pažymėtas Wnt1-Cre (A').Priešingai, Specc11 mutantiniai embrionai rodo atviras nervines raukšles (B), rodyklių galvutes ir CNCC, kurios nemigravo (B', rodyklių galvutės).(C, D') E10.5 WT embrionų (C, C') ir Specc1l (D, D') CNCC žymeklio DLX2 šviesaus lauko vaizdai (C, D') ir imuninis dažymas (C', D').WT E10.5 embrionuose DLX2 teigiamas CNCC kolonizuoja žiaunų lankus (C', rodyklės), o mutantuose pastebimas dažymas išlieka atvirose nervinėse raukšlėse (D', rodyklės) ir pirmuosiuose ryklės lankuose (D', rodyklėmis).) su tam tikru dažymu (rodyklėmis), rodančiu prastą CNCC delaminaciją ir migraciją.ER) WT ir Specc1l mutantų embrionų sekcijos E8.5 (E–L) ir E9.5 (M–R) stadijose buvo paženklintos NCC žymenimis SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) ir DLX2 (I, J, Q, R).E8.5 metu NCC dažymas buvo pastebėtas laukinio tipo nervinės raukšlės (NF) ir mutantų skyriuose.Bendras SOX10 ir β-katenino dažymas E8.5 WT (K) ir mutantas (L) atskleidė padidėjusį β-katenino dažymą ląstelių ribose nervinėse raukšlėse.E9.5 metu buvo pastebėtas laukinio tipo migruojančių CNCC (M, O, Q) dažymas, o mutantų atveju nesluoksniuoti CNCC nudažo atviras nervines raukšles (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ ženklinimo analizė WT ir Specc11DTM096/RRH048 embrionų su E9.5 mutacija vainikinėse dalyse.Viršutiniame dešiniajame kampe parodyta apytikslė pjūvio plokštuma.Mutantinių audinių pjūviuose buvo pastebėtas padidėjęs F-aktino (S, T) ir miozino IIb (U, V) dažymas.Panašiai kaip ir in vitro 3 pav., mutantiniuose embrionuose buvo pastebėtas sustiprintas β-katenino (W, X) ir E-kadherino (Y, Z) membranos dažymas.(AA-BB) Laukinio tipo embriono dalies elektroninė mikrografija, žiūrinti už viršūninės-bazinės ląstelės ribos, rodo skirtingą elektronų tankį regioną, rodantį lipnias jungtis (AA, rodyklės).Priešingai, Specc11 mutantinių embrionų skyriuose (BB, rodyklės) visa apikobazinė jungtis yra tanki elektronais, o tai rodo padidėjusį lipnių jungčių tankį ir dispersiją.
Norėdami patikrinti mūsų hipotezę, kad sumažėjęs sluoksniavimasis atsiranda dėl pakitusio AJ, ištyrėme AJ žymėjimą veikiamose Specc1l mutantų embrionų nervinėse raukšlėse (5S-Z pav.).Pastebėjome aktino streso skaidulų padidėjimą (5S pav., T) ir kartu padidėjusį miozino IIB dažymo lokalizaciją ant aktino skaidulų (5U pav., V).Svarbu tai, kad tarpląstelinėse ribose pastebėjome padidėjusį β-katenino (5W, X pav.) ir E-kadherino (5Y, Z pav.) dažymąsi.Taip pat ištyrėme E8.5 embrionų nervinių raukšlių NCC dažymą β-kateninu (5K pav., L).Atrodė, kad β-katenino dažymas buvo stipresnis Specc1l mutantinėse nervinėse raukšlėse (5L ir K pav.), o tai rodo, kad prasidėjo AJ pokyčiai.E9.5 embrionų kaukolės pjūvių elektroninėse mikrografijose vėl pastebėjome, kad Specc1l mutantiniuose embrionuose, lyginant su WT, padidėjo difuzinis tankus elektronų dažymas (5AA pav., BB ir S1E-H).Visi šie rezultatai patvirtina mūsų in vitro rezultatus SPECC1L-kd U2OS ląstelėse ir rodo, kad mūsų mutantiniuose embrionuose prieš CNCC stratifikaciją yra AJ dažymas.
Atsižvelgiant į žinomą antagonistinį ryšį tarp AKT aktyvumo ir E-kadherino stabilumo, 17, 28 iškėlėme hipotezę, kad dalyvauja PI3K-AKT signalizacija.Be to, kai kuriuose mūsų mutantiniuose embrionuose pastebėjome subepiderminį pūslių susidarymą, kurie išvengė mirtingumo (<5%) E9,5–10,5, o vietoj to nusistovėjo maždaug E13,5 (S3 pav.).Subepiderminės pūslelės yra sumažėjusio PI3K-AKT signalizacijos, pagrįstos PDGFRα12, požymis.Fantauzzo ir kt.(2014) pranešė, kad sutrikus PDGFRα pagrindu veikiančiam PI3K aktyvavimui PdgfraPI3K/PI3K mutantiniuose embrionuose, atsiranda subepiderminės pūslelės, nervinio vamzdelio defektai ir gomurio skilimo fenotipai.Iš tiesų, pan-AKT ir aktyvaus fosforilinto Ser473-AKT lygiai buvo sumažinti in vivo Specc1l mutantiniuose audiniuose iki E9.5 embriono sustojimo (6A-D pav.).Fosforilinto Ser473-AKT lygių sumažėjimas gali būti visiškai dėl pan-AKT lygių sumažėjimo in vivo (6E pav.) ir in vitro (6F pav.).In vitro sumažėjimas buvo pastebėtas tik tada, kai U2OS ląstelės buvo stipriai susiliejančios su ląstelių formos ir AJ tankio pokyčiais (6D pav.).Taigi, mūsų duomenys rodo, kad SPECC1L yra naujas teigiamas PI3K-AKT signalizacijos reguliatorius kaukolės ir veido morfogenezėje.
(A–E) E8.5 (A, B) ir E9.5 (C, D) kaukolės pjūviai arba E9.5 lizatai iš Specc1l mutantinių embrionų (E), rodantys aktyvaus fosforilinto S473-AKT ir pan-AKT baltymų kiekio sumažėjimą , palyginti su kontroline WT.Western blot buvo atliktas su laukinio tipo lizatais ir mutantiniais lizatais tomis pačiomis sąlygomis.SPECC1L rodomi vaizdai buvo paimti iš vienos dėmės.Ta pati dėmė buvo pašalinta ir iš naujo ištirta naudojant anti-pan-ACT ir β-aktino antikūnus.Pan-AKT lygis E8.5 nervinėse raukšlėse (A, B) ir fosforilinto S473-AKT lygis E9.5 kaukolės skyriuose buvo žymiai sumažintas.(F) Pan-AKT lygis buvo panašiai sumažintas SPECC1L-kd U2OS ląstelių lizatuose, surinktuose esant dideliam susiliejimui.Klaidų juostos rodo SEM iš trijų nepriklausomų Western blot kiekybinių įvertinimų.(GJ) WT embrionų sekcijos ties E9.5, atitinkamai nudažytos KI67 ir suskaidyta kaspaze 3, rodančios ląstelių proliferaciją (G, G') ir nedidelį apoptotinį aktyvumą (H, H').Specc11 mutantiniai embrionai rodo panašų ląstelių proliferaciją (I), tačiau ląstelių, kurioms taikoma apoptozė, skaičius žymiai padidėja (J).
Tada ištyrėme proliferacijos ir apoptozės žymenis.Nepastebėjome jokio skirtumo tarp E9.5 embrionų proliferacijos (6E pav., G, palyginti su I), kai proliferacijos indeksas WT mutantams buvo 82,5%, o Specc1l mutantams – 86,5%, išmatuotas dažant KI67 (p <0,56, Fisher's). tikslus testas).Panašiai mes nepastebėjome jokio apoptozės skirtumo, išmatuoto dažant suskaidytą kaspazę 3 nervinėse raukšlėse ties E8.5 iki embriono sustojimo (neparodyta) (neparodyta).Priešingai, apoptozė buvo žymiai padidėjusi visuose E9.5 mutantiniuose embrionuose (6F pav., H ir J).Šis bendras apoptozės padidėjimas atitinka sumažėjusį PI3K-AKT signalizavimą ir ankstyvą embriono mirtingumą 29, 30, 31.
Toliau, norėdami patvirtinti priežastinį PI3K-AKT signalizacijos vaidmenį mūsų kd ląstelių AJ pokyčiuose, chemiškai pakeitėme kontrolės ir kd ląstelių kelią (7A-F pav.).Kaip žymeklį naudojome susiliejusiose SPECC1L-kd ląstelėse pastebėtą ląstelių formos pasikeitimo fenotipą, kurį kiekybiškai įvertinome naudodami ilgiausio matmens (ilgio) ir atitinkamo vertikalaus matmens (pločio) santykį.Tikimasi, kad santykinai apvalių arba kuboidinių ląstelių santykis yra 1 (7G pav.).Be ląstelių formos, mes taip pat patvirtinome β-katenino dažymo poveikį AJ (7A-F pav.).PI3K-AKT kelio slopinimo naudojant wortmannin pakako, kad pakeistų ląstelių formą kontrolinėse ląstelėse (7A, C pav.) ir AJ (7A pav.).PI3K-AKT aktyvatorius SC-79 neturėjo įtakos ląstelių formai (Fig. 7A, E) arba AJ išsiplėtimui (Fig. 7A') kontrolinėse ląstelėse.SPECC1L-kd ląstelėse tolesnis PI3K-AKT kelio slopinimas padidino apoptozę (7B, D pav.) ir ženkliai padidino β-katenino dažymą (7B pav.), atitinkantį mūsų in vivo sunkiuosius mutantus.Svarbu tai, kad PI3K-AKT kelio aktyvinimas žymiai pagerino ląstelių formą (7B, F pav.) ir AJ fenotipus (7B pav.).Ląstelių formos pokyčiai buvo kiekybiškai įvertinti kaip ląstelės apvalumo santykis (CCR) ir lyginami pagal reikšmingumą, kaip aprašyta aukščiau (7G pav.).Iš tiesų, kontrolinėse ląstelėse (7G pav., CCR = 1,56) gydymo wortmannin pakako, kad ląstelės forma būtų reikšmingai pakeista (7G pav., CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) tiek, kiek buvo pastebėta. SPECC1L.-kd ląstelės (7G pav., CCR = 3,46).SPECC1L-kd ląstelių apdorojimas Wortmannin (7G pav., CCR = 3,60, nereikšmingas) nebuvo reikšmingesnis nei neapdorotų kd ląstelių (7G pav., CCR = 3,46, nereikšmingas) arba wortmannin apdorotų kontrolinių ląstelių (7G pav.)., CCR = 3,46, nereikšmingas) papildomai veikia ląstelių pailgėjimą (7G, CCR = 3,61, nereikšmingas).Svarbiausia, kad SC-79 AKT aktyvatorius atkūrė pailgėjusį SPECC1L-kd ląstelių fenotipą (7G pav., CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Šie rezultatai patvirtina, kad SPECC1L reguliuoja PI3K-AKT signalizaciją ir rodo, kad vidutinis SPECC1L sumažėjimas veikia ląstelių adheziją, o stiprus sumažėjimas sukelia apoptozę (8 pav.).
(A–F') Kontrolės (A, C, E) ir SPECC1L-kd (B, D, F) ląstelės, apdorotos PI3K-AKT kelio inhibitoriumi wortmannin (C, D) arba SC-79 aktyvatoriumi (E, F). .Neapdorotos kontrolinės ląstelės yra kubo formos (A) su normaliu β-katės ląstelių dažymu (A'), o kd ląstelės yra pailgos (B) su padidėjusiu β-katės dažymu (B').Nuslopinus PI3K-AKT kelią, kontrolinės ląstelės pailgėjo (C) su β-katės išsiplėtimu (C'), o kd ląstelės pradėjo patirti apoptozę (D), panašiai kaip mūsų labai mutuoti embrionai ir pasižymintys itin sustiprintu β-katu.dažymas (D').Suaktyvinus PI3K-AKT kelią, kontrolinės ląstelės išliko kubo formos (E) ir turėjo normalų β-katės (E') dažymą, o kd ląstelės žymiai pagerėjo ląstelių forma (F) ir β-katės (F') dažymas, o tai rodo. (G) Ląstelės formos pasikeitimo laipsnis (AF) buvo kiekybiškai įvertintas naudojant ilgiausio matmens (ilgio) ir atitinkamo vertikalaus matmens (pločio) ląstelių apvalumo santykį (CCR), naudojant MetaMorph programinę įrangą.Neapdorotos (NT) SPECC1L-kd ląstelės (CCR = 3,46) buvo žymiai ilgesnės nei kontrolinės ląstelės (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Wort'o PI3K-AKT kelio slopinimo kontrolinėse ląstelėse pakako, kad ląstelės forma pailgėtų panašiai (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Panašiai, AKT aktyvinimas SC-79 SPECC1L-kd ląstelėse atkūrė ląstelių pailgėjimą iki kontrolinio lygio (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).SPECC1L-kd ląstelių gydymas Wortmannin padidino apoptozę, bet toliau nepadidėjo ląstelių formos pokytis (CCR=3,60), palyginti su neapdorotomis kd (CCR=3,46, ns) arba wortmannin apdorotomis kontrolinėmis ląstelėmis (3,61), pastebėtomis .ns = nesvarbu.Rodomi +/- SEM matavimai 50 ląstelių.Statistiniai skirtumai buvo apskaičiuoti naudojant Stjudento t-testą.
(A) Scheminis PI3K-AKT kelio slopinimo ir aktyvavimo vaizdas, dėl kurio atitinkamai atsiranda AJ pokyčiai ir gelbėjimas.(B) Siūlomas SPECC1L AKT baltymų stabilizavimo modelis.
Premigruojantys CNCC reikalauja AJ lizės, kad atsiskirtų nuo priekinės nervinės raukšlės neuroepitelinių ląstelių 1, 15, 32.Padidėjęs AJ komponentų dažymas ir viršūninio-bazinio AJ asimetrinio pasiskirstymo praradimas ląstelėse, kuriose trūksta SPECC1L tiek in vitro, tiek in vivo, kartu su fiziniu SPECC1L artumu β-kateninui, rodo, kad SPECC1L veikia tinkamai palaikyti AJ vietinį stabilumą organizaciniai raumenys.aktino citoskeletas.SPECC1L ryšys su aktino citoskeletu ir β-kateninu bei kondensuotų aktino gijų skaičiaus padidėjimas nesant SPECC1L atitinka pastebėtą AJ tankio padidėjimą.Kita galimybė yra ta, kad padidėjęs aktino skaidulų skaičius ląstelėse, kuriose trūksta SPECC1L, keičia tarpląstelinę įtampą.Kadangi ląstelių įtampa turi įtakos AJ 33 dinamikai, įtampos pokyčiai gali sukelti labiau išsklaidytą AJ 34 .Taigi bet kokie pakeitimai turės įtakos CNCC sluoksniams.
Wnt1 yra išreikštas ankstyvosiose nervinėse raukšlėse, dėl kurių atsiranda nervų keteros ląstelės.Taigi, Wnt1-cre linijos sekimas žymi tiek prieš, tiek migruojantį NCC35.Tačiau Wnt1 taip pat žymi nugaros smegenų audinio klonus, taip pat gautus iš ankstyvųjų nervinių raukšlių 35, 36 , todėl tikėtina, kad mūsų E9.5 mutantų dažymas Wnt1 žymenims atvirose nervinėse raukšlėse nėra CNCC.Mūsų teigiamas NCC žymenų AP2A ir SOX10 dažymas patvirtino, kad atskleistose Specc11 mutantų embrionų nervinėse raukšlėse iš tikrųjų buvo CNCC.Be to, kadangi AP2A ir SOX10 yra ankstyvos migracijos NCC žymenys, teigiamas dažymas parodė, kad šios ląstelės yra po migracijos CNCC, kurių negalima stratifikuoti pagal E9.5.
Mūsų duomenys rodo, kad SPECC1L molekulinį AJ reguliavimą tarpininkauja PI3K-AKT signalizacija.AKT signalizacija sumažėja ląstelėse ir audiniuose, kuriuose trūksta SPECC1L.Fantauzzo ir kt. išvados.palaiko tiesioginį PI3K-AKT signalizacijos vaidmenį kaukolės ir veido morfogenezėje.(2014) parodė, kad nesuaktyvėjus PDGFRα pagrindu veikiančiam PI3K-AKT signalizavimui, atsiranda gomurio skilimo fenotipas.Taip pat parodome, kad PI3K-AKT kelio slopinimas yra pakankamas, kad pakeistų AJ ir ląstelių formą U2OS ląstelėse.Remiantis mūsų išvadomis, Cain ir kt.37 parodė, kad sumažėjęs PI3K α110 subvieneto reguliavimas endotelio ląstelėse sukelia panašų periceliulinio β-katenino dažymo padidėjimą, vadinamą „jungiamumo indekso“ padidėjimu.Tačiau endotelio ląstelėse, kurių aktino gijos jau yra labai organizuotos, PI3K-AKT kelio slopinimas lemia laisvą ląstelių formą.Priešingai, SPECC1L-kd U2OS ląstelės parodė pailgą ląstelių formą.Šis skirtumas gali priklausyti nuo ląstelių tipo.Nors PI3K-AKT signalizacijos slopinimas visam laikui paveikia aktino citoskeletą, poveikį ląstelės formai lemia įtampos pokyčiai, kuriuos sukelia centrinių aktino skaidulų tankio ir organizavimo pokyčiai.U2OS ląstelėse naudojome tik ląstelių formos pokyčius kaip SPECC1L trūkumo AJ pokyčių ir atsigavimo žymeklį.Apibendrinant galima teigti, kad AKT kelio slopinimas esant SPECC1L trūkumui padidina AJ stabilumą ir sumažina CNCC delaminaciją.
Įdomu tai, kad pan-AKT lygis buvo sumažintas in vitro ir in vivo, be fosforilinto 473-AKT lygio, nesant SPECC1L, o tai rodo PI3K-AKT signalizacijos reguliavimą AKT baltymų stabilumo arba apyvartos lygiu.SPECC1L ir MID1 genai, abu susiję su Opitz / GBBB sindromu, koduoja baltymus, stabilizuojančius mikrotubules 18, 22 .Mechanizmas, kuriuo SPECC1L ir MID1 tarpininkauja mikrotubulų stabilizavimui, nėra visiškai suprantamas.SPECC1L atveju šis stabilizavimas apima sustiprintą mikrotubulių pogrupio acetilinimą18.Gali būti, kad SPECC1L naudoja panašų mechanizmą, kad stabilizuotų kitus baltymus, tokius kaip AKT.Įrodyta, kad lizino liekanų acetilinimas AKT baltyme sumažina membranos lokalizaciją ir fosforilinimą38.Be to, K63 grandinės ubikvitinacija toje pačioje AKT lizino liekanoje reikalinga jos membranai lokalizuoti ir aktyvuoti 39, 40.Tarp kelių veiksnių, sąveikaujančių su SPECC1L baltymais, nustatytų įvairiuose didelio našumo mielių dviejų hibridų ekranuose, keturi – CCDC841, ECM2942, APC ir UBE2I43 – buvo susiję su baltymų apykaita arba stabilumu per ubikvitinaciją arba sumoilinimą.SPECC1L gali būti susijęs su potransliaciniu AKT lizino likučių modifikavimu, turinčiu įtakos AKT stabilumui.Tačiau dar reikia išsiaiškinti kritinį SPECC1L vaidmenį AKT baltymo lokalizacijoje ir stabilumui.
Dėl didelių SPECC1L ekspresijos defektų in vivo padidėjo AJ žymenų dažymas ir CNCC defektas, taip pat padidėjo apoptozė ir ankstyvas embriono mirtingumas.Ankstesnės ataskaitos parodė, kad pelių mutantai su padidėjusiu apoptozės lygiu yra susiję su nervinio vamzdelio defektais 44, 45, 46, 47 ir kaukolės veido defektais .Buvo pasiūlyta, kad dėl pernelyg didelės ląstelių mirties nervinėse raukšlėse ar ryklės lankuose gali atsirasti nepakankamas ląstelių skaičius, reikalingas tinkamam morfogenetiniam judėjimui 48, 49, 50.Priešingai, mūsų SPECC1L trūkumų turinčios ląstelių linijos su vidutiniškai sumažėjusia SPECC1L ekspresija parodė tik AJ pokyčius be padidėjusios ląstelių mirties įrodymų.Tačiau cheminis PI3K-AKT kelio slopinimas šiose Kd ląstelėse padidino apoptozę.Taigi vidutinis SPECC1L ekspresijos ar funkcijos sumažėjimas užtikrina ląstelių išlikimą.Tai atitinka pastebėjimą, kad reti Specc11 mutantiniai embrionai, kurie išvengia arešto šv.E9.5 – galbūt dėl ​​sumažėjusio genų gaudymo efektyvumo – gali uždaryti savo nervinius vamzdelius ir sustoti vėliau, dažnai su kaukolės ir veido defektais (S3 pav.).Tai taip pat atitinka retas heterozigotinių Specc1l embrionų su kaukolės ir veido anomalijų atvejis – tikriausiai dėl padidėjusio genų gaudymo efektyvumo – taip pat zebrafinių žuvų radinys, kai vienas iš dviejų SPECC1L ortologų (specc1lb) sukelia vėlyvuosius embrioninius fenotipus, įskaitant apatiniai žandikauliai ir dvišaliai plyšiai51.Taigi, heterozigotinės SPECC1L funkcijos praradimo mutacijos, nustatytos žmonėms, gali sukelti nedidelius SPECC1L funkcijos sutrikimus kaukolės ir veido morfogenezės metu, kurių pakanka paaiškinti jų burnos ir veido plyšius.SPECC1L pagrįstas tarpląstelinių kontaktų reguliavimas taip pat gali turėti įtakos palatogenezei ir ryklės lankų susiliejimui.Tolesni SPECC1L funkcijos tyrimai padės išsiaiškinti laikinų tarpląstelinių kontaktų vaidmenį CNCC uždarant nervinį vamzdelį neuroepitelinių ląstelių judrumui ir kaukolės ir veido morfogenezei.
U2OS osteosarkomos kontrolė ir SPECC1L-kd ląstelės buvo aprašytos anksčiau (Saadi ir kt., 2011).Antikūnai prieš SPECC1L taip pat buvo apibūdinti anksčiau (Saadi ir kt., 2011).Anti-β-katenino antikūnai (triušis; 1:1000; Santa Cruz, Dalasas, Teksasas) (pelė; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miozinas IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, Sent Luisas ) , MO) ), E-kadherinas (1: 1000; Abkam, Kembridžas, MA), AP2A (1: 1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1: 1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diegas , Kalifornija), DLX2 (1:1000; Abcam, Kembridžas, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), suskaidyta kaspazė 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ir β-aktinas (1:2500; Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO ) buvo naudojamas kaip aprašyta..Aktino gijos buvo nudažytos Acti-stain rodamino faloidinu (Cytoskeleton, Denveris, Koloradas).
U2OS kontrolinės ląstelės ir SPECC1L-kd ląstelės buvo kultivuojamos standartiniame didelio gliukozės kiekio DMEM, papildytame 10% vaisiaus galvijų serumu (Life Technologies, Carlsbad, CA).Dėl AJ pokyčių 2 x 105 ląstelės buvo pasėtos ant stiklo, apdoroto 0, 1% kiaulių želatina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ir stebima, ar keičiasi ląstelių forma.Ląstelės buvo renkamos skirtingais nurodytais laiko momentais: 4 valandos po sėjos (t = 1), 24 valandos po sėjos (t = 2), susiliejimas be ląstelės formos pasikeitimo (t = 3), ląstelės formos pasikeitimas (t = 4) , 24 val. po ląstelės formos pasikeitimo (t = 5) ir 48 val. po ląstelės formos pasikeitimo (t = 6) (1, 2, 3 pav.).Norint moduliuoti PI3K-AKT kelią, ląstelės buvo kultivuojamos nurodytomis koncentracijomis naudojant PI3K-AKT inhibitorių wortmannin (TOCRIS Biosciences, Mineapolis, Minesota) arba SC-79 aktyvatorių (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minesota).Terpė, kurioje yra cheminių medžiagų, buvo keičiama kasdien.
Kadras po kadro buvo įrašyti gyvose kontrolinėse ir KD ląstelėse normaliomis auginimo sąlygomis, o fazės kontrasto vaizdai buvo renkami kas 10 minučių 7 dienas.Vaizdai buvo gauti naudojant kompiuteriu valdomą Leica DM IRB apverstą mikroskopą su mechanine stadija ir 10 × N-PLAN objektyvu, prijungtu prie QImaging Retiga-SRV fotoaparato.Atliekant vaizdą, ląstelių kultūros buvo palaikomos 37 ° C temperatūroje drėgnoje atmosferoje su 5% CO2.
Dvi genų gaudyklės ES ląstelių linijos DTM096 ir RRH048 iš Regioninio Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) buvo panaudotos Spec11 trūkumų turinčioms pelių linijoms generuoti, pažymėtoms Specc1lgtDTM096 ir Specc1lgtRRH046.Trumpai tariant, 129 / REJ ES ląstelės buvo sušvirkštos į C57BL6 blastocistas.Gauti chimeriniai pelių patinai buvo veisiami su C57BL6 pelių patelėmis, kad būtų galima identifikuoti palikuonis su agouti kailio spalva.Genų gaudyklės vektoriaus intarpų buvimas buvo naudojamas heterozigotams identifikuoti.Pelės buvo laikomos mišriame 129/REJ; C57BL6 fone.Genetinio spąstų vektoriaus įterpimo vietos vieta buvo patvirtinta RT-PCR, genomo sekos nustatymu ir genetine komplementacija (papildomas 1 paveikslas).Norint atsekti dvigubų heterozigotinių Specc1lGT pelių CNCC liniją, ROSAmTmG (#007576) ir Wnt1-Cre (#003829) pelės (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) buvo sukryžmintos, kad būtų gautas ROSAmTmG ir Wnt1-Cre mutantas Speccosl embrionuose.Visi eksperimentai su pelėmis buvo atlikti pagal Kanzaso universiteto medicinos centro Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto patvirtintus protokolus.
Embrionai buvo fiksuoti (1 % formaldehido, 0,2 % glutaraldehido, 2 mM MgCl2, 0,02 % NP-40, 5 mM EGTA) 60 min. kambario temperatūroje.Po fiksacijos X-gal dažymo tirpale (5 mM kalio fericianidas, 5 mM kalio ferocianidas, 2 mM MgCl2, 0,01 % natrio deoksicholatas, 0,02 % NP-40, 1 mg/ml X-gal) Dėmės išryškėjo 37°C temperatūroje. .°C per 1-6 valandas.Embrionai buvo fiksuoti 4% PFA ir vizualizuoti.
Western blot būdu ląstelės buvo lizuojamos pasyviajame lizės buferyje (Promega, Fitchburg, WI), papildytu HALT proteazės inhibitorių mišiniu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lizatai buvo apdoroti 12% poliakrilamido Mini-PROTEAN TGX paruoštais geliais (Bio-Rad, Hercules, CA) ir perkelti į Immobilon PVDF membranas (EMD Millipore, Billerica, MA).Membranos buvo užblokuotos 5% piene PBS, kuriame yra 0, 1% Tween.Antikūnai buvo inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje arba vieną valandą kambario temperatūroje.Signalo generavimui buvo naudojamas Femto SuperSignal West ECL reagentas (Thermo Scientific, Waltham, MA).Imuniniam dažymui embrionai buvo fiksuoti per naktį 4% PFA / PBS ir užšaldyti.Audinių kriosekcijos buvo užblokuotos PBS, kuriame yra 1% normalaus ožkos serumo (Thermo Scientific, Waltham, MA) ir 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO), o po to inkubuojamos 4 °C temperatūroje inkubatoriuje. naktis.su anti-antikūnu ir fluorescenciniu antriniu antikūnu (1:1000) 1 valandą 4 °C temperatūroje.Dažytos sekcijos buvo patalpintos į ProLong aukso terpę (Thermo Scientific, Waltham MA), o plokšti vaizdai buvo gauti naudojant Leica TCS SPE konfokalinį mikroskopą.Kiekvienas imuninis dažymas buvo atliktas kaip trys nepriklausomi eksperimentai su mažiausiai dviejų mutantų embrionų cirosekcijomis.Parodytas reprezentatyvus eksperimentas.
Ląstelės buvo inkubuojamos modifikuotame RIPA buferyje (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 % NP-40, 130 mM NaCl, 10 % glicerolio, 2 mM EDTA ir HALT proteazės inhibitorius (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Trumpai tariant, lizatai buvo iš anksto išgryninti baltymo G magnetinėmis granulėmis (Life Technologies, Carlsbad, CA), o po to inkubuojami per naktį 4 ° C temperatūroje su anti-SPECC1L arba IgG baltymo G granulėmis, buvo naudojami SPECC1L ekstrahavimui, o Western blot buvo atliktas naudojant anti-SPECC1L. -β-katenino antikūnas, aprašytas aukščiau. Rodomi bendro IP eksperimentai reprezentuoja keturis nepriklausomus eksperimentus.
Fiksuotos kultivuotos ląstelės arba pelių embrioniniai audiniai buvo pateikti Kanzaso universiteto medicinos centro elektroninės mikroskopijos centrui.Trumpai tariant, mėginiai buvo įterpti į EMbed 812 dervą (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerizuoti per naktį 60 ° C temperatūroje ir suskirstyti 80 nm, naudojant Leica UC7 ultramikrotomą su deimantiniu peiliuku.Pjūviai buvo vizualizuoti naudojant JEOL JEM-1400 perdavimo elektronų mikroskopą su 100 kV Lab6 pistoletu.
Kaip cituoti šį straipsnį: Wilson, NR ir kt.SPECC1L trūkumas padidina susijungusių jungčių stabilumą ir sumažina kaukolės nervinių sluoksnių ląstelių atsiskyrimą.Mokslas.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Nervų keteros indukcija ir diferenciacija.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience / Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR ir kt.Judančios kaukolės nervų keteros ląstelės: jų vaidmuo kaukolės ir veido vystymuisi.Amerikos medicinos genetikos žurnalas.A dalis 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: jos augimas ir vystymasis per 20 metų.Pediatras.patologija.laboratorija.vaistas.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU ir Noten MM Proveržis burnos veido plyšių genetikoje.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. ir Riley, FM Molekuliniai kaukolės nervo keteros ląstelių migracijos ir modeliavimo mechanizmai kaukolės ir veido vystymosi metu.Plėtra 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH ir Murray, JK. Lūpos ir gomurio plyšimas: genetinės ir aplinkos įtakos supratimas.natūralus komentaras.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR ir kt.Nenormali odos, galūnių ir kaukolės ir veido srities morfogenezė pelėms, kurioms trūksta interferoną reguliuojančio faktoriaus-6 (Irf6).Nacionalinė Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. ir kt.Dominuojančios GRHL3 mutacijos sukelia van der Waord sindromą ir sutrikdo burnos peridermos vystymąsi.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ ir Juriloff, DM Atnaujinkite pelių mutantų, turinčių nervinio vamzdelio uždarymo defektų, sąrašą ir pažangą link visiško nervinio vamzdelio uždarymo genetinio supratimo.Įgimtų defektų tyrimas.A dalis, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA ir Soriano, P. PI3K sukeltas PDGFRalpha signalizavimas reguliuoja išgyvenimą ir proliferaciją skeleto vystymesi per nuo p53 priklausomą tarpląstelinį kelią.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND ir Murdoch, JN Disheveled: konvergentinio išsiplėtimo ryšys su nervinio vamzdelio uždarymu.Neurologijos tendencijos.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).